利多卡因緩解心肌缺血再灌注大鼠心臟功能和免疫紊亂并抑制NF-κB p38MAPK的活化①

鄭琢 吳沁娟 溫虎成 劉少星 謝先豐（成都市第二人民醫(yī)院麻醉科，成都610000）

心肌缺血再灌注（myocardial ischemia-reperfusion，MI/R）是心肌組織血流供應(yīng)突然中斷一定時間后恢復(fù)正常灌注，但心肌細胞的損傷不僅沒有得到緩解反而繼續(xù)加重的現(xiàn)象［1-2］。心肌缺血會引起心肌超微結(jié)構(gòu)變化、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、免疫紊亂等一系列損傷性變化，嚴重的會因心律失常而導(dǎo)致猝死［3-6］。目前治療MI/R可以通過抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)免疫來減輕MI/R損傷［7］。利多卡因（Lidocaine）是一種常見的局部麻醉及抗心律失常藥，利多卡因可通過促進心肌細胞內(nèi)K+外流，降低心肌的自律性，起到抗室性心律失常作用［8］。但目前關(guān)于利多卡因緩解MI/R大鼠心臟功能和免疫紊亂的機制尚不完全統(tǒng)一。本文旨在研究利多卡因緩解MI/R大鼠心臟功能和免疫紊亂的機制，為MI/R損傷的治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物SPF級3周齡SD大鼠75只，購自廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，粵監(jiān)證字2014A029號，本實驗經(jīng)過動物倫理委員會批準同意。

1.1.2 藥物與試劑利多卡因注射液（國藥準字：H20043676；生產(chǎn)廠家：國藥集團容生制藥有限公司）購自同濟堂大藥房；中性福爾馬林、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司；TNF-α試劑盒、IL-10試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；TNF-α抗體、IL-10抗體、p65抗體、p38抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP羊抗兔IgG等二抗購自美國Thermo公司。

1.1.3 儀器全自動生化分析儀（型號：Sysmexchemix-180）購自日本Furuno Electric公司；顯微鏡（型號：SG-51）購自上海光學(xué)儀器廠；電子天平（型號：BS-124s）購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；彩色多普勒超聲儀（型號：DW-T6）購自江蘇大為醫(yī)療有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自以色列DNR公司；臺式離心機（型號：TDL-5）購自上海安亭科學(xué)儀器廠；低溫離心機購自湖南恒諾離心機有限公司；小動物Medlab生物信號采集系統(tǒng)購自南京美易公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及建立模型將75只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機數(shù)字表法分為：Control組、MI/R組、MI/R+Lidocaine 1.25 mg/kg組、MI/R+Lidocaine 2.5 mg/kg組 和MI/R+Lidocaine 5 mg/kg組，每 組15只。除了Control組外各組大鼠采用冠脈結(jié)扎手術(shù)制備心肌缺血再灌注模型［6］。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg麻醉，切開左胸第2～5肋之間的皮膚，分離皮下組織及前鋸肌和胸大肌后切開第2～3肋間肌暴露心臟，結(jié)扎使得心肌細胞缺血，缺血時間為15 min后灌注10 min，1 h后再次缺血15 min后灌注10 min，消毒，縫合。動脈結(jié)扎后使用心電圖檢測結(jié)果顯示ST段上抬0.2 mV以上，持續(xù)30 min后打開結(jié)扎線，恢復(fù)血流灌注，心電圖J點抬高，T波異常視為造模成功。Control組大鼠僅切開左胸暴露心臟不結(jié)扎，本實驗造模過程中共死亡12只大鼠，已使用備用大鼠頂替保證每組為15只。

1.2.2 藥物干預(yù)根據(jù)大鼠體重配置好對應(yīng)劑量的利多卡因，稀釋至2 ml，所有大鼠造模前腹腔注射1 ml，完成造模后再次注射1 ml，Control組注射等量的生理鹽水。

1.2.3 檢測項目

平常評價茶葉好壞主要運用感官審評方法，受評茶員主觀影響大。筆者將新工藝黃觀音紅茶與傳統(tǒng)工藝紅茶通過內(nèi)含物檢測分析、香氣檢測分析及感官審評結(jié)果相結(jié)合的方法進行比較，所得結(jié)果更具客觀性和參考價值[4]。

1.2.3.1 心損標記物檢測從頸總動脈插管接取1 ml大鼠血液，按照肌酸激酶同工酶（creatine kinase-Mb，CK-Mb）、肌酸激酶Mb（creatine kinase，Mb）和心肌肌鈣蛋白（cardiac troponin，cTnI）試劑盒操作方法檢測其含量水平。

1.2.3.2 超聲檢測大鼠心臟指標采用DW-T6彩色多普勒超聲儀檢測各組大鼠左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fractions，LVEF）、左室收縮壓水平（left ventricular systolic pressure，LVSP）、心 率（heart rate，HR）和左室短軸縮短率（fraction shortening，F(xiàn)S）。

1.2.3.3 HE染色觀察大鼠心肌損傷完成大鼠心臟指標檢測后立即斷頸法處死大鼠，使用聚甲醛灌注固定，取大鼠心肌組織，二甲苯浸泡后酒精梯度脫水，蘇木精浸泡后鹽酸酒精分化，氨水沖洗，使用伊紅染色，酒精浸泡脫水，中性樹膠封片，在400倍鏡觀察大鼠心肌細胞狀態(tài)。

1.2.3.4 TUNEL染色觀察心肌組織凋亡情況取上述固定好的大鼠心臟組織，使用石蠟包埋并切片、放入二甲苯中脫蠟、水化、PBS洗滌、加入TUNEL檢測液，避光孵育45 min，加入DAPI染細胞核，置于400倍的光學(xué)顯微鏡下觀察，每視野計數(shù)100個細胞中的凋亡率，凋亡率=（凋亡細胞/總細胞）×100%。

1.2.3.5 ELISA檢測外周血中炎癥因子水平取上述大鼠頸總動脈插管接取的血液，使用TNF-α、IL-10試劑盒檢測大鼠外周血中TNF-α、IL-10含量水平，操作方法嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.2.3.6 Western blot檢測蛋白表達水平取大鼠心肌組織，剪刀剪碎后胰蛋白酶消化，用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的一抗、二抗，孵育2 h，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，顯色液顯色后采用凝膠成像系統(tǒng)行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad Prism5作圖，多組間比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；若P＜0.05則表明數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，本研究所有檢驗均為雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中心損標記物比較檢測大鼠心損標記物結(jié)果顯示，相比Control組MI/R組大鼠Mb、CK-Mb、cTnI水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；相比MI/R組MI/R+Lidocaine 1.25mg/kg組大鼠Mb、CK-Mb、cTnI水平改變無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；相比MI/R組MI/R+Lidocaine 2.5 mg/kg組和MI/R+Lidocaine 5 mg/kg組Mb、CK-Mb、cTnI水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠血清中心損標記物比較Fig.1 Comparison of serum myocardial injury markers among all groups

圖2 各組大鼠HR、FS、LVSP、LVEF比較Fig.2 Comparison of HR，F(xiàn)S，LVSP and LVEF among all groups

2.3 HE染色觀察大鼠心肌病理情況及TUNEL染色觀察大鼠心肌凋亡HE染色結(jié)果顯示，Control組大鼠心肌外膜和心肌纖維完整，心肌纖維縱切面可見周期性橫紋；MI/R組大鼠心肌纖維彎曲、肌束膜破裂、肌細胞核固縮、溶解；使用利多卡因處理后大鼠心肌肌纖維斷裂溶解顯著減少肌纖維縱切面可見明暗相間帶，肌細胞核溶解、固縮顯著減少，見圖3A。

圖3 HE染色觀察大鼠心肌病理情況及TUNEL染色觀察大鼠心肌凋亡（×400）Fig.3 Observation of myocardial pathology by HE staining and myocardial apoptosis by TUNEL staining（×400）

TUNEL染色結(jié)果顯示，相比Control組MI/R組大鼠心肌細胞凋亡率顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；相比MI/R組MI/R+Lidocaine1.25mg/kg組大鼠心肌細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；相比MI/R組MI/R+Lidocaine 2.5 mg/kg組和MI/R+Lidocaine 5 mg/kg組大鼠心肌細胞凋亡率顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3B。

2.4 各組大鼠外周血中炎癥因子比較檢測大鼠外周血炎癥因子結(jié)果顯示，相比Control組MI/R組大鼠外周血TNF-α和IL-10水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；相比MI/R組MI/R+Lidocaine 1.25 mg/kg組大鼠外周血TNF-α和IL-10水平改變無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；相比MI/R組MI/R+Lidocaine 2.5 mg/kg組和MI/R+Lidocaine 5 mg/kg組大鼠外周血TNF-α水平顯著降低，IL-10水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組大鼠外周血中炎癥因子比較Fig.4 Comparison of inflammatory factors in peripheral blood among all groups

Western blot結(jié)果顯示，相比Control組MI/R組大鼠心肌組織TNF-α和IL-10水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；相比MI/R組MI/R+Lidocaine 1.25 mg/kg組大鼠心肌組織TNF-α和IL-10水平改變差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；相比MI/R組MI/R+Lidocaine 2.5 mg/kg組和MI/R+Lidocaine 5 mg/kg組大鼠心肌組織TNF-α水平顯著降低，IL-10水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

2.5 各組大鼠心肌組織p65及p38磷酸化檢測結(jié)果Western blot結(jié)果顯示，相比Control組MI/R組大鼠心肌組織p-p65/p65蛋白、p-p38/p38蛋白顯著升高；相比MI/R組MI/R+Lidocaine 1.25 mg/kg組大鼠心肌組織p-p65/p65蛋白表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），p-p38/p38蛋白表達變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；相比MI/R組MI/R+Lidocaine 2.5 mg/kg組 和MI/R+Lidocaine 5 mg/kg組 大鼠心肌組織p-p65/p65蛋白、p-p38/p38蛋白顯著降低，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織p65及p38磷酸化檢測結(jié)果Fig.5 Test results of p65 and p38 phosphorylation in myocardial tissues of each group

3 討論

目前常見的心肌損傷的生物標志物主要包括：Mb、CK-Mb、Mb和cTnI［9］。周 偉 梁 等［10］和LIEBETRAU等［11］的研究顯示，當心肌細胞受損時，Mb、CKMb、Mb和cTnI會通過破裂的細胞迅速釋放到血液中，因此可以作為心肌損傷的生物標志物。cTnI是一種在心肌細胞中含量豐富的特殊蛋白質(zhì)，當心肌受損時，cTnI則會釋放，隨后進入血液循環(huán)系統(tǒng)，使得外周血中cTnI含量水平升高［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，相比MI/R組MI/R+Lidocaine 1.25 mg/kg組大鼠Mb、CK-Mb、cTnI水平改變無統(tǒng)計學(xué)意義；相比MI/R組MI/R+Lidocaine 2.5 mg/kg組和MI/R+Lidocaine 5 mg/kg組Mb、CK-Mb、cTnI水平顯著降低。說明使用利多卡因可以有效緩解心肌受損的程度，但當使用劑量較低時效果并不顯著。丁丹［13］研究表明：利多卡因可以降低CK-Mb、cTnI等心損標記物，有效緩解MI/R損傷，與本研究得出的結(jié)論相一致。

MI/R損傷會出現(xiàn)心律失常，同時相應(yīng)血流動力學(xué)也會受到影響［14］。檢測心功能的血流動力學(xué)指標主要包括：HR、FS、LVSP、LVEF。HR指心臟每分鐘跳動的次數(shù)。FS是左心室舒張末期的內(nèi)徑減去左心室收縮末期內(nèi)徑，比上左心室舒張末期內(nèi)徑的百分比，可以有效反映心臟收縮和舒張的能力。LVSP是心臟向動脈射血的主要動力，在心臟舒張時內(nèi)壓降低，腔靜脈血壓回流入心臟，心臟每收縮和舒張一次構(gòu)成一個心動周期［15］。LVEF是每搏輸出量占心室舒張末期容積量的百分比，可以有效反映心臟收縮能力。本研究發(fā)現(xiàn)，相比MI/R組MI/R+Lidocaine

2.5 mg/kg組 和MI/R+Lidocaine 5 mg/kg組 大 鼠HR、FS、LVSP、LVEF水平顯著升高。說明使用利多卡因可以有效增強大鼠心臟收縮和舒張能力，增強大鼠心臟功能。同時本實驗發(fā)現(xiàn)相比MI/R組MI/R+Lidocaine 1.25 mg/kg組大鼠HR、FS、LVSP、LVEF水平均無顯著改變，說明低劑量的利多卡因效果不明顯，當劑量大于2.5 mg/kg才會有顯著的效果。

炎癥反應(yīng)是心肌細胞缺血再灌注后發(fā)生的一系列免疫反應(yīng)［16］。免疫炎癥細胞因子主要包括：促炎癥因子和抑炎癥因子。促炎癥因子主要包括TNF-α、IL-1β等，其中TNF-α由單核細胞、巨噬細胞和非免疫細胞等分泌，是主要的促炎癥因子［17-18］。抑炎癥因子包括：IL-10、IL-4、IL-13等，主要由Th2細胞分泌，可以抑制炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，相比MI/R組MI/R+Lidocaine 1.25 mg/kg組大鼠外周血TNF-α和IL-10水平無明顯改變；相比MI/R組MI/R+Lidocaine 2.5 mg/kg組和MI/R+Lidocaine 5 mg/kg組大鼠外周血TNF-α水平顯著降低，IL-10水平顯著升高。說明使用利多卡因可以有效降低大鼠心肌缺血后的炎癥反應(yīng)同時促進抑炎癥因子的表達，實現(xiàn)緩解大鼠炎癥反應(yīng)的功能。劉改霞等［19］研究表明：利多卡因可以有效抑制炎癥反應(yīng)，與本研究得出的結(jié)論相一致。

核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，其廣泛存在于真核細胞內(nèi)，參與多種基因的調(diào)控，對細胞的增殖、分化和凋亡起著重要作用［20］。NF-κBp65的磷酸化可有效反映其被活化的程度，當NF-κBp65被活化后會促進細胞的凋亡。本實驗結(jié)果顯示，相比MI/R組MI/R+Lidocaine

2.5 mg/kg組 和MI/R+Lidocaine 5 mg/kg組 大鼠 心肌組織中NF-κBp65活化水平降低，同時通過TUNEL染色發(fā)現(xiàn)大鼠心肌細胞凋亡率顯著降低。說明利多卡因可以通過抑制NF-κBp65的活化實現(xiàn)抑制心肌細胞的凋亡。p38的磷酸化可以有效反映MAPK的活化程度，本研究檢測發(fā)現(xiàn)使用利多卡因有效抑制了p38的磷酸化，說明使用利多卡因可以通過抑制NF-κB p38MAPK的活化緩解大鼠心肌缺血再灌輸損傷。韓雪［21］研究表明：抑制MAPKs/NF-κB的活化可以有效保護大鼠心肌細胞，與本研究得出的結(jié)論相一致。

綜上所述，利多卡因可以有效緩解大鼠心肌缺血再灌注損傷，其作用機制與抑制炎癥反應(yīng)和蛋白表達相關(guān)。