脂多糖誘導(dǎo)大鼠子宮內(nèi)膜損傷模型的建立與評價

夏 燕，劉 露，林丹換，張夢莉，練 冰，覃春容

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518000）

近年來，隨著人工流產(chǎn)術(shù)、清宮術(shù)等宮腔操作的增加，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎及子宮內(nèi)膜過薄等情況逐年增多。子宮內(nèi)膜過薄可導(dǎo)致不孕及胚胎反復(fù)種植失?。╮ecurrent implantation failure，RIF）。由于子宮內(nèi)膜損傷及損傷后修復(fù)過程的人體組織標本不易獲得，因此對子宮內(nèi)膜損傷方面的研究多局限于對超聲檢查獲取的影像學(xué)資料進行研究。子宮內(nèi)膜損傷動物模型的建立，成為研究子宮內(nèi)膜損傷與修復(fù)的可行工具與方法，可為探索子宮內(nèi)膜損傷的可能病因、子宮內(nèi)膜的修復(fù)機制及促進子宮內(nèi)膜的修復(fù)再生、改善妊娠結(jié)局等找到一個更為合理的研究載體。本研究利用不同濃度的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對大鼠進行宮腔灌注，嘗試構(gòu)建更符合子宮內(nèi)膜損傷條件的大鼠子內(nèi)膜損傷動物模型并驗證造模是否成功，為下一步子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)機制的研究提供條件。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

性成熟、未交配的特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雌性SD大鼠（由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司實驗動物中心提供）24只，其周齡為6～8周齡，體重為220～260 g。實驗嚴格按照動物倫理學(xué)標準開展。對這些大鼠進行常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，每周在固定時間對其進行陰道涂片檢查，觀察其動情周期。

1.2 試劑及儀器

LPS（由Sigma公司生產(chǎn)），生理鹽水（由山東華魯制藥有限公司生產(chǎn)），正置顯微鏡（由0lympus 公司生產(chǎn)），組織脫水機（由湖北康強醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)），石蠟包埋機（由湖北泰維科技視野有限公司生產(chǎn)），石蠟切片機（由徠卡公司生產(chǎn)），IMS圖像分析系統(tǒng)（由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)） ，PBS緩沖液（由無錫傲銳東源生物科技有限公司生產(chǎn)），10%的中性福爾馬林（由Solarbio公司生產(chǎn)），無水乙醇（由上海潤捷化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)），二甲苯（由上海潤捷化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)），蘇木素（由BASO公司生產(chǎn)），伊紅（由BASO公司生產(chǎn)），石蠟（由Leica公司生產(chǎn)）。

1.3 分組及動物模型構(gòu)建

將24只SD大鼠分為LPS 10 mg/mL組、LPS 20 mg/mL組（合稱為LPS處理組大鼠）和對照組，每組各有8只大鼠。讓三組大鼠禁食12～14 h后，用10%的水合氯醛對其實施麻醉。麻醉起效后，固定大鼠，使其腹部朝上。將細軟管針輕輕插入大鼠的陰道內(nèi)，分別向LPS 10 mg/mL組、LPS 20 mg/mL組和對照組大鼠的宮腔內(nèi)注入100 μL濃度為10 mg/mL的LPS、濃度為20 mg/mL的LPS和生理鹽水，完成建模操作。待三組大鼠清醒后，將其放回籠內(nèi)進行常規(guī)喂養(yǎng)及持續(xù)觀察。建模完成后48 h，將大鼠處死，取其血清及子宮。將每只大鼠的Y型子宮分成2份備用，將其中一份子宮浸泡于4%的多聚甲醛中進行固定。對子宮標本進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，采用IMS圖像分析系統(tǒng)測量三組大鼠子宮內(nèi)膜的厚度。在光鏡下觀察三組大鼠子宮內(nèi)膜的厚度、腺體和血管的分布情況、各層細胞的形態(tài)學(xué)改變等。對三組大鼠的子宮標本進行免疫組化染色，觀察CK19和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在子宮內(nèi)膜及基層等部位的表達情況。

1.4 觀察指標

觀察造模后三組大鼠的一般情況（包括體重、子宮的外觀、形態(tài)等）。觀察造模后三組大鼠子宮的組織形態(tài)學(xué)特點及子宮組織中CK19和TNF-α的表達情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

用GraphPad Prism 8軟件對本研究中的數(shù)據(jù)進行處理，各組動物的體重等實驗結(jié)果以平均值±標準誤差（Mean±SEM）表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模后三組大鼠的一般情況

造模后，三組大鼠的體重無明顯差異（詳見圖1）。造模前對三組大鼠進行觀察發(fā)現(xiàn)，其子宮外觀呈粉紅色，粗細均勻，有彈性和光澤。造模后，LPS處理組大鼠的子宮發(fā)白，質(zhì)地變硬，對照組大鼠子宮的顏色及形態(tài)無明顯變化。

圖1 造模后三組大鼠體重的比較

2.2 造模后三組大鼠子宮的組織形態(tài)學(xué)特點

造模后，與對照組大鼠相比，LPS處理組大鼠的子宮內(nèi)膜層明顯變薄，宮腔腔隙增大，與肌層界限不清楚；其子宮內(nèi)膜上皮和腺上皮細胞扁平化，內(nèi)膜上皮細胞排列紊亂，間質(zhì)充血水腫，腺體數(shù)量明顯減少；LPS 20 mg/mL組大鼠子宮內(nèi)膜層變薄尤為明顯。詳見圖2。

圖2 造模后三組大鼠子宮的組織形態(tài)學(xué)特點

2.3 造模后三組大鼠子宮組織中CK19和TNF-α的表達情況

CK19在正常大鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞中呈高表達。造模后，對照組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞中的CK19呈強陽性表達，在子宮肌層中也有表達，但主要以內(nèi)膜上皮細胞表達為主；LPS處理組大鼠子宮內(nèi)膜上皮的正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，上皮細胞結(jié)構(gòu)不清，其子宮內(nèi)膜上皮細胞中CK19的表達弱于對照組大鼠，且CK19在子宮肌層中的表達也弱于對照組大鼠；隨著LPS劑量的增大，大鼠子宮內(nèi)膜損傷破壞程度逐漸加劇，其子宮內(nèi)膜上皮細胞中CK19的表達逐漸越低。造模后，對照組大鼠子宮內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)較為完整，其子宮內(nèi)膜和肌層中TNF-α的表達水平較低；LPS處理組大鼠的子宮內(nèi)膜出現(xiàn)不同程度的損傷，TNF-α在其子宮內(nèi)膜和肌層中均有表達；隨著LPS誘導(dǎo)劑量的加大，大鼠子宮內(nèi)膜和肌層中TNF-α的表達水平逐漸升高；LPS處理組大鼠子宮內(nèi)膜和肌層中TNF-α的表達水平顯著高于對照組大鼠。詳見圖3。

圖3 造模后三組大鼠子宮組織中CK19和TNF-α的表達情況

3 討論

子宮內(nèi)膜炎、宮腔粘連、子宮疤痕、子宮內(nèi)膜過薄、子宮內(nèi)膜血供減少等子宮病變被臨床上認為是引起RIF的主要因素之一。上述子宮病變可直接影響受精卵的著床及輔助生殖過程中孕卵移植的成功率。研究指出，子宮內(nèi)膜過薄是導(dǎo)致部分育齡女性不孕的原因之一，而RIF是影響輔助生殖技術(shù)成功率的重要因素。單純子宮內(nèi)膜過薄患者和RIF患者都會因子宮內(nèi)膜的容受性下降、子宮內(nèi)膜局部血供減少而影響胚胎的著床，進而可導(dǎo)致其不孕。目前，通過改善子宮內(nèi)膜的修復(fù)機制增加子宮內(nèi)膜的血供，進而改善子宮內(nèi)膜容受性的方法尚未見相關(guān)的研究報道。近年來，國內(nèi)外的相關(guān)研究已嘗試建立子宮內(nèi)膜損傷研究的動物模型（所選實驗動物主要有大鼠、小鼠、新西蘭兔、恒河猴等，造模方法有機械性損傷法、化學(xué)損傷法、熱損傷法、感染性損傷法、缺血性損傷法、電磁波損傷法及聯(lián)合損傷法等），但尚未獲得相對可靠的動物模型，且尚無針對子宮內(nèi)膜損傷程度及子宮內(nèi)膜損傷動物模型預(yù)后的評價標準?，F(xiàn)階段，建立單純薄型子宮內(nèi)膜動物模型的方法主要為高濃度乙醇宮腔注射損傷法[1]，也有學(xué)者通過熱損傷法建立薄型子宮內(nèi)膜動物模型[2]。有研究通過宮腔放置銅絲和機械搔刮造成的雙重損傷構(gòu)建新西蘭兔宮腔粘連模型[3]、小鼠子宮內(nèi)膜損傷粘連模型[4-5]等多種動物模型。本課題采用LPS宮腔灌注誘導(dǎo)法建立大鼠子宮內(nèi)膜損傷模型[6]，效果顯著，建模時間和LPS的用量均可控。該方法較細菌感染法、電損傷法等建模方法有明顯優(yōu)勢[7]。大鼠的子宮由外至內(nèi)可分為漿膜層、肌層和內(nèi)膜層，其中內(nèi)膜層最厚。大鼠子宮的組織結(jié)構(gòu)與人類相似，均由不同作用的功能層和基底層組成，故本實驗采用SD大鼠進行造模。

本實驗的結(jié)果證實，LPS可有效地誘導(dǎo)大鼠子宮內(nèi)膜損傷，LPS的最佳誘導(dǎo)劑量為20 mg/mL。LPS可作為一種損傷誘導(dǎo)劑成功構(gòu)建大鼠子宮內(nèi)膜損傷模型。