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    影響新型冠狀病毒核酸檢測陽性檢出率的因素

    2021-12-03 04:25:35文鋮熹
    當(dāng)代醫(yī)藥論叢 2021年16期
    關(guān)鍵詞:核酸試劑標(biāo)本

    劉 琛,文鋮熹

    〔1.中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院(光明)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,廣東 深圳 518107;2.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(深圳)預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)2班,廣東 深圳518107〕

    2020年2月11日,國際病毒分類委員會宣布將新型冠狀病毒(2019-nCoV)正式命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)。 世 界 衛(wèi) 生 組 織(World Health Organization,WHO)同日宣布,將由SARS-CoV-2導(dǎo)致的疾病正式命名為新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)。目前醫(yī)學(xué)界已確定新型冠狀病毒肺炎(新冠肺炎)的傳播方式有經(jīng)呼吸道飛沫傳播、直接接觸傳播、氣溶膠傳播、糞口傳播等[1]。新型冠狀病毒屬于冠狀病毒家族的新成員,為陽性單鏈RNA病毒[2]。對新型冠狀病毒進(jìn)行分離鑒定是確診新冠肺炎的主要依據(jù),但各基層醫(yī)院在對新型冠狀病毒進(jìn)行分離鑒定時常因人員、設(shè)備等問題而導(dǎo)致分離鑒定失敗,其臨床應(yīng)用的局限性較大。進(jìn)行新型冠狀病毒抗原抗體檢測具有操作簡便的優(yōu)點(diǎn),適用于對大規(guī)模人群進(jìn)行新冠肺炎篩查,但檢測過程中存在抗原交叉、血液成分干擾(干擾因子為類風(fēng)濕因子、非特異性IgM等)等問題。采用核酸檢測診斷新冠肺炎的靈敏性和特異性較高,在新冠肺炎的防治中發(fā)揮著重要作用[3]。目前全國二級以上醫(yī)院都開展了新型冠狀病毒核酸檢測工作,但在檢驗(yàn)工作中普遍存在陽性檢出率不理想的情況[4]。本文就影響新型冠狀病毒核酸檢測陽性檢出率的因素進(jìn)行分析和總結(jié)。

    1 檢測前的影響因素

    據(jù)統(tǒng)計(jì),新型冠狀病毒核酸檢測過程中的檢驗(yàn)質(zhì)量問題多集中在檢驗(yàn)前的階段[5],涉及以下幾個方面。

    1.1 標(biāo)本采集人員因素

    新型冠狀病毒具有強(qiáng)傳染性,因此核酸采集人員在采集標(biāo)本時要嚴(yán)格執(zhí)行三級防護(hù)標(biāo)準(zhǔn),且必須經(jīng)過系統(tǒng)的采樣手法培訓(xùn)。核酸采集人員在采集標(biāo)本時要做到以下幾點(diǎn):1)采樣部位需深入。2)采集的細(xì)胞數(shù)應(yīng)足量。3)采集時應(yīng)避開腺體(腺體分泌物含RNA酶,易降解病毒RNA,導(dǎo)致陽性檢出率下降)。核酸采集人員在采集標(biāo)本時若未嚴(yán)格按照上述要求操作,就會出現(xiàn)采樣不合格的情況,進(jìn)而可影響檢測結(jié)果[6]。

    1.2 病毒保存管因素

    RNA酶是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶。除細(xì)胞內(nèi)存在RNA酶外,外界環(huán)境中的灰塵、各種實(shí)驗(yàn)器皿和試劑、人類皮膚的汗液、唾液中均存在RNA酶。外界環(huán)境中的RNA酶易降解新型冠狀病毒的RNA,因此在采集標(biāo)本后應(yīng)盡量選擇添加RNA抑制酶的病毒保存管保存標(biāo)本,并迅速旋緊蓋頭。若未采用添加RNA抑制酶的病毒保存管保存標(biāo)本,就可能導(dǎo)致新型冠狀病毒的RNA被降解,影響其陽性檢出率。

    1.3 呼吸道取樣材料因素

    有學(xué)者采用帶病毒保存液的植絨拭子和無病毒保存液的普通棉簽拭子對新冠肺炎確診患者進(jìn)行標(biāo)本采集,發(fā)現(xiàn)用普通棉簽拭子采集的標(biāo)本新型冠狀病毒核酸檢測的陽性檢出率明顯低于帶病毒保存液的植絨拭子(P<0.05)[7]。這可能與植絨拭子易采集更多的口鼻分泌物且在病毒保存液中更易洗脫細(xì)胞有關(guān)。

    1.4 標(biāo)本來源因素

    呼吸道標(biāo)本包括鼻咽拭子、咽拭子、呼吸道抽吸物、痰液、支氣管肺泡灌洗液等。陳煒等[8]研究發(fā)現(xiàn),痰液標(biāo)本中新型冠狀病毒的含量高于咽拭子標(biāo)本,這可能與新型冠狀病毒易侵襲感染下呼吸道和肺有關(guān);咽拭子不易采集到足量的細(xì)胞數(shù),以咽拭子為標(biāo)本進(jìn)行新型冠狀病毒核酸檢測的陽性檢出率僅有30%~50%。因此,對于接受氣管切開術(shù)的患者應(yīng)優(yōu)先考慮采集其下呼吸道標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測。在采集咽拭子標(biāo)本時應(yīng)盡可能多的采集細(xì)胞,也可將多部位采集到的標(biāo)本合并為一份標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測[9]。

    1.5 標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)因素

    新型冠狀病毒具有強(qiáng)感染性,也易降解,因此應(yīng)使用密封性好的A類生物安全運(yùn)輸箱(如UN2814)進(jìn)行冷藏(2℃~8℃)運(yùn)輸,并盡早送檢,防止因標(biāo)本降解而導(dǎo)致陽性檢出率降低。

    2 檢測過程中的影響因素

    檢測過程中影響新型冠狀病毒核酸檢測陽性檢出率的因素涉及以下幾方面。

    2.1 標(biāo)本滅活因素

    新型冠狀病毒對紫外線和熱敏感,56℃下加熱30 min、乙醚、75%的乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效地滅活該病毒[10]。新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測專家共識建議采用56℃下加熱30 min的方式滅活新型冠狀病毒。標(biāo)本滅活處理是生物安全防護(hù)的重要措施。目前實(shí)驗(yàn)室在檢測新型冠狀病毒標(biāo)本前均會對標(biāo)本實(shí)施滅活處理。當(dāng)標(biāo)本病毒的濃度較高時,滅活與否對新型冠狀病毒核酸陽性檢出率的影響不大。但當(dāng)標(biāo)本病毒的濃度較低時,進(jìn)行滅活可導(dǎo)致病毒RNA降解,造成陽性檢出率下降[11]。因此在實(shí)際工作中應(yīng)準(zhǔn)確控制病毒滅活的溫度和時間。

    2.2 試劑配制因素

    檢測新型冠狀病毒所用的核酸試劑若配置過久或反復(fù)凍融,可導(dǎo)致其中的逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶活性下降,使實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增效率降低,進(jìn)而可導(dǎo)致弱陽性標(biāo)本出現(xiàn)漏檢的情況,影響檢查結(jié)果。

    2.3 核酸提取因素

    采用一步法提取新型冠狀病毒的核酸可直接將樣本加入反應(yīng)體系,具有操作簡單的優(yōu)點(diǎn),但漏檢率較高,診斷的敏感性較差,不推薦使用。采用手工過柱提取法提取新型冠狀病毒核酸的漏檢率較低,診斷的敏感性較高,但操作步驟繁瑣,耗時久。采用磁珠法提取新型冠狀病毒核酸使用的儀器為自動核酸提取儀,具有操作簡單、高效、提取核酸濃度及純度高等優(yōu)勢,可用于大批量新型冠狀病毒核酸的提取[12]。

    2.4 質(zhì)量控制因素

    在進(jìn)行新型冠狀病毒核酸檢測的過程中需設(shè)置三陰一陽的質(zhì)控監(jiān)測樣品,將其隨機(jī)放在臨床標(biāo)本中間進(jìn)行檢測,當(dāng)陽性質(zhì)控樣品測定為陽性、3個陰性質(zhì)控樣品全部測定為陰性時,可視為在控[13]。通過試劑盒自帶的內(nèi)標(biāo)檢測,可對標(biāo)本采集、提取及擴(kuò)增進(jìn)行質(zhì)量控制[14]。無癥狀感染者、病毒感染初期者及即將治愈出院的患者體內(nèi)的病毒含量較低,為了提高此類患者新型冠狀病毒的陽性檢出率,可將陽性質(zhì)控樣品改為弱陽性質(zhì)控樣品。與強(qiáng)陽性質(zhì)控樣品相比,弱陽性質(zhì)控樣品可更靈敏地反映核酸檢測體系是否存在假陰性的問題[15]。在對無癥狀感染者、病毒感染初期者及即將治愈出院的患者進(jìn)行新型冠狀病毒核酸檢測時若未使用弱陽性質(zhì)控樣品,可導(dǎo)致陽性檢出率偏低。

    2.5 擴(kuò)增試劑因素

    不同品牌擴(kuò)增試劑靶標(biāo)基因位點(diǎn)的敏感性不同,且不同試劑的脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、金屬離子、引物序列、探針序列等成分有所差異,可影響檢測的準(zhǔn)確度和靈敏度。對核酸檢測試劑盒的評價,不能僅以其CT值的高低來評估其質(zhì)量,應(yīng)綜合選擇漏檢率低尤其是對低濃度核酸具有較高擴(kuò)增能力的試劑盒進(jìn)行新型冠狀病毒核酸檢測,以提高陽性檢出率[12]。

    3 新型冠狀病毒自身特質(zhì)因素

    3.1 病毒變異因素

    目前大多數(shù)新型冠狀病毒檢測試劑都是靶向病毒的特定區(qū)域,通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)擴(kuò)增病毒的ORFlab基因和N基因進(jìn)行熒光定量檢測。但新型冠狀病毒屬于單鏈RNA病毒,不穩(wěn)定、易變異。目前臨床上關(guān)于病毒基因的變異頻率如何、是否存在突變熱點(diǎn)等尚未可知。而核酸檢測試劑只能根據(jù)有限的公開數(shù)據(jù)進(jìn)行引物設(shè)計(jì),若出現(xiàn)變異病毒混合流行的情況,則易導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性[6]。

    3.2 疾病進(jìn)展因素

    無癥狀感染者、病毒感染初期者及即將治愈出院的患者體內(nèi)的病毒含量較低,易導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性。若遇到此類情況,應(yīng)對患者進(jìn)行多次核酸檢測,并聯(lián)合進(jìn)行抗原抗體檢測,結(jié)合患者的臨床癥狀、流行病學(xué)史、影像學(xué)檢查結(jié)果等進(jìn)行綜合分析。

    4 總結(jié)

    核酸檢測在此次新冠肺炎疫情的診療、防治過程中發(fā)揮著重要作用,但檢測過程易受到諸多因素的影響而導(dǎo)致陽性檢出率偏低。在實(shí)際檢測工作中應(yīng)從以下幾個方面著手,以提高新型冠狀病毒核酸檢測的陽性檢出率:1)正確地采集、運(yùn)輸及保存檢測標(biāo)本。2)選用合適的核酸提取儀器和試劑。3)規(guī)范核酸檢測流程。4)加強(qiáng)對檢測環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)量控制。

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