穗花杉雙黃酮抑制小兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)研究

傅 娟,劉媛媛,李 霞

(1.固原市人民醫(yī)院,寧夏 固原 756000;2.合陽(yáng)縣人民醫(yī)院,陜西 合陽(yáng) 715316;3.西安高新醫(yī)院,陜西 西安 710075)

小兒血管瘤(Infantile hemangioma,IH)是一種良性血管瘤，在出生后迅速擴(kuò)散，最終纖維脂肪組織所替代[1]。大部分血管瘤可自行消退，在4%～5%的患兒中，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，包括：甲狀腺功能減退、弱視、肝衰竭、潰瘍和出血、甚至危及存活[2-4]。藥物治療、手術(shù)切除和硬化治療作為常見的血管瘤治療方法均不能獲得理想的治療效果[5]，因此在臨床和基礎(chǔ)研究上，尋找和探索安全有效的血管瘤治療藥物和方法顯得極為重要。由于中藥活性單體來(lái)源豐富，價(jià)格低廉和藥效穩(wěn)定，越來(lái)越多的科研工作者致力于中藥單體抗癌的研究，比如雷公藤紅素可抑制胃癌細(xì)胞體外增殖[6]、南方紅豆杉提取物可抑制人前列腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡[7]，龍葵堿通過(guò)調(diào)控p53蛋白表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞增殖[8]。穗花杉雙黃酮(Amentoflame,AF)是一種從穗花杉中提取的黃酮類化合物，現(xiàn)代藥理研究[9-10]證明，AF具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種作用。近年來(lái)有研究[11]報(bào)道，AF具有抑制血管生成的作用，并能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，但其對(duì)IH內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖以及β-catenin信號(hào)通路的影響尚不清楚。本研究旨在探討AF對(duì)IH內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖的影響及其機(jī)制，藉此為IH的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 IH內(nèi)皮細(xì)胞購(gòu)自上海美軒生物科技有限公司。AF購(gòu)于北京百諾威生物科技有限公司，純度≥98%，AF由 DMSO 溶解。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，MTT 試劑購(gòu)于美國(guó)Promega 公司，SDS-PAGE配制試劑盒購(gòu)于中國(guó)碧云天生物公司,BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司，RIPA 裂解液購(gòu)于中國(guó)碧云天生物公司，細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司,Cyclin D1、p21、β-catenin 和GAPDH 抗體均購(gòu)于美國(guó)Cell Signal Technology公司，免疫組化試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD Pharmingen 公司，熒光定量PCR儀購(gòu)于德國(guó)耶拿公司，高速冷凍離心機(jī)、深低溫冰箱購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司，全自動(dòng)酶標(biāo)儀和細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo 公司，轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)于美國(guó)Bio-RAD 公司，倒置顯微鏡購(gòu)于德國(guó)Zeiss公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：IH內(nèi)皮細(xì)胞由DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，DMEM 完全培養(yǎng)基包含1% 雙抗，10%胎牛血清，每3 d更換培養(yǎng)基，細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80% 時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化、傳代和接種。

1.2.2 MTS法檢測(cè)AF對(duì)IH內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響：消化傳代細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，得到細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，每孔接種0.2 ml細(xì)胞懸液，次日，棄掉培養(yǎng)基，分別加入含0、25、50、75、125 μmol/L AF的DMEM 完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入20 μl MTS，繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔讀數(shù)，檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm。

1.2.3 細(xì)胞周期檢測(cè)：根據(jù)MTS結(jié)果，僅選擇75 μmol/L AF用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)作為實(shí)驗(yàn)組、0 μmol/L AF為對(duì)照組。將IH內(nèi)皮細(xì)胞以每孔2×105個(gè)/ml的密度接種至6 孔細(xì)胞板，次日，棄掉培養(yǎng)基，加入不含AF或含有75 μmol/L AF的DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，消化細(xì)胞并收集至離心管中,1500 r/min離心5 min。棄去上清，加入預(yù)冷70%乙醇，4 ℃固定4 h，參照試劑盒說(shuō)明書的步驟檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)增殖相關(guān)蛋白表達(dá)水平：將小兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞以每孔2×105個(gè)/ml的密度接種至6孔細(xì)胞板，次日，棄掉培養(yǎng)基，加入不含AF或含有75 μmol/L AF的DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗3次，加入RIPA 裂解液，在冰上收集培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定提取總蛋白的濃度。將蛋白進(jìn)行變性并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白(每孔上樣30 μg)，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后，將膜用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h，分別加入一抗β-catenin(1∶1000)、Cyclin D1(1∶1000)、p21(1∶1 000)和GAPDH(1∶1000)稀釋液，將膜放入4 ℃冰箱搖床上，孵育過(guò)夜，次日加入TBST洗3次，分別加入二抗(1∶3000)稀釋液，用ECL 發(fā)光液浸膜后，避光孵育 5 min，用凝膠成像儀進(jìn)行顯色反應(yīng)并拍照記錄，用GAPDH作為內(nèi)參，用Image Lab 3.0軟件進(jìn)行條帶定量分析。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)增殖相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平：將IH內(nèi)皮細(xì)胞以每孔2×105個(gè)/ml的密度接種至6 孔細(xì)胞板，次日，棄掉培養(yǎng)基，加入不含AF或含有75 μmol/L AF的DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)基，收集培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞，采用Trizol 法提取總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒以總RNA為模板合成cDNA。配制含有2 μl cDNA、6 μl ddH2O、10 μl SYBP Premix Ex Taq 和各1 μl上下游引物的反應(yīng)體系，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，退火和延伸65 ℃、35 s，40個(gè)循環(huán)。GAPDH 作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，各引物序列見表1。

表1 PCR基因引物序列相關(guān)信息

2 結(jié) 果

2.1 AF對(duì)IH內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響 見圖1。當(dāng)AF濃度為25、50 μmol/L時(shí)，AF對(duì)小兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞活性沒(méi)有顯著作用，當(dāng)AF濃度為75、125 μmol/L 時(shí)，AF顯著抑制小兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞活性，與0 μmol/L AF的對(duì)照組相比，其組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，因此，將75 μmol/L AF用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2 AF對(duì)IH內(nèi)皮細(xì)胞周期的影響 見表2 。根據(jù)AF對(duì)IH內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，75 μmol/L AF可顯著抑制IH內(nèi)皮細(xì)胞活性，所以，在周期實(shí)驗(yàn)中，仍以75 μmol/L AF組進(jìn)行研究，與對(duì)照組相比，AF組中，處于G0/G1期的IH內(nèi)皮細(xì)胞比例顯著增加，處于S期的IH內(nèi)皮細(xì)胞比例顯著減少，其組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表2 兩組細(xì)胞周期分布比較(%)

2.3 AF對(duì)IH內(nèi)皮細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白 mRNA表達(dá)水平的影響 見圖2。與對(duì)照組相比，AF組中，β-catenin和Cyclin D1 mRNA表達(dá)量顯著減少，p21 mRNA表達(dá)量顯著增加，其組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.4 AF對(duì)IH內(nèi)皮細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 見圖3。與對(duì)照組相比，AF組中，β-catenin和Cyclin D1蛋白表達(dá)量顯著減少，p21蛋白表達(dá)量顯著增加，其組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

3 討 論

IH是小兒中最常見的良性血管腫瘤，通常在出生后幾天內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，并經(jīng)歷獨(dú)特的疾病過(guò)程，其中快速增殖階段之后自發(fā)性消退[12]，但仍有10%～15%的患者會(huì)因?yàn)檠芰龅某掷m(xù)增長(zhǎng)而引發(fā)各項(xiàng)機(jī)體功能障礙[13]。臨床上，治療IH一般采用手術(shù)切除，手術(shù)切除僅限于一些皮膚部位，但對(duì)于一些特殊部位，比如眼、耳和鼻等，則不適宜手術(shù)切除[14]，因此尋找用于治療血管瘤安全有效且低廉的治療藥物極為緊迫。

AF是一種來(lái)源于的卷柏的黃酮類中藥單體，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗腫瘤、抗輻射、清除自由基的作用[15]，文獻(xiàn)報(bào)道，AF 具有抑制ECV304細(xì)胞遷移的作用，并且能夠抑制ECV30細(xì)胞體外血管樣結(jié)構(gòu)的形成[16]。本研究通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AF可顯著抑制IH內(nèi)皮細(xì)胞增殖，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot探明了AF可顯著抑制IH內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，即AF抑制了IH內(nèi)皮細(xì)胞β-catenin，Cyclin D1和p21蛋白和mRNA的表達(dá)。β-catenin是一種典型的黏連蛋白，是經(jīng)典的Wnt信號(hào)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在各類細(xì)胞中起著黏連并傳遞信號(hào)的作用[17]，Cyclin D1作為β-catenin的靶蛋白，β-catenin活化可促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[18]，這與文獻(xiàn)報(bào)道的AF通過(guò)調(diào)節(jié)β-catenin的表達(dá)抑制人大腸癌細(xì)胞SW480增殖的結(jié)論相一致[19]。

Cyclin D1和p21，作為細(xì)胞周期調(diào)控的中樞，在Cyclin D1/CDK/CKI增殖信號(hào)通路中發(fā)揮著極為重要的作用，是G1期到S期過(guò)渡階段的監(jiān)測(cè)點(diǎn)[20-21]。細(xì)胞周期抑制蛋白p21可以抑制Cyclin D1的表達(dá)[22]，本文AF促進(jìn)IH內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)p21的表達(dá)并顯著抑制Cyclin D1的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1期，進(jìn)而抑制了IH內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步增殖。Liu 等[23]證實(shí)AF通過(guò)ROS/AMPK/mTOR 信號(hào)通路抑制SKOV3 和OVCAR-3 卵巢癌細(xì)胞S 期激酶相關(guān)蛋白2(Skp2)的表達(dá)。李云霄等[24]證實(shí)AF可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，本研究的結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道相一致，并進(jìn)一步證實(shí)穗花杉雙黃酮對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。王曜暉等[25]證實(shí)AF可抑制3T3-L1細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，可作為抑制細(xì)胞增殖的藥物。本研究對(duì)IH內(nèi)皮細(xì)胞的影響僅從周期和增殖方面進(jìn)行研究，AF對(duì)IH內(nèi)皮細(xì)胞的促凋亡作用尚未深入探究，下一步研究需要從增殖和凋亡兩方面深入探究AF對(duì)IH內(nèi)皮細(xì)胞的影響。

綜上所述，AF可抑制IH內(nèi)皮細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞內(nèi)周期蛋白有關(guān)。這一研究結(jié)果為AF用于臨床治療IH提供了理論依據(jù)。