基于正交試驗(yàn)補(bǔ)噓養(yǎng)勒顆粒提取制備工藝研究*

何天富，方 剛，陳曉藝，李清平，羅宇東，秦超燕

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠研發(fā)部，南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯醫(yī)藥學(xué)院，南寧 530001；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530001）

產(chǎn)后缺乳為常見(jiàn)產(chǎn)后病，始于《諸病源候論》記錄為“產(chǎn)后乳無(wú)汁候”[1]。有學(xué)者探討氣血虛弱、肝郁氣滯、痰濕壅盛是引起該病癥重要原因[2]。目前沒(méi)有針對(duì)產(chǎn)后缺乳明確的診療方案，常以中藥湯劑及針灸作為主流治療手段[3-6]，而壯醫(yī)治療產(chǎn)后缺乳方面有顯著特色[7]。補(bǔ)噓養(yǎng)勒方為借鑒名老中醫(yī)的學(xué)術(shù)思想，根據(jù)壯醫(yī)藥理論開(kāi)發(fā)的治療產(chǎn)后缺乳的經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用效果良好。補(bǔ)噓養(yǎng)勒方由五指毛桃、當(dāng)歸、田七、麥冬、川芎、木瓜組成。課題組在此理論和有效的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)上，采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，對(duì)補(bǔ)噓養(yǎng)勒方進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)提取、制備工藝的研究，將補(bǔ)噓養(yǎng)勒方優(yōu)化成質(zhì)量可控、穩(wěn)定，療效確切，方便攜帶的補(bǔ)噓養(yǎng)勒顆粒，為后期的生產(chǎn)制備提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器設(shè)備

LC-2030C 3D 型高效液相色譜儀（島津中國(guó)儀器有限公司）AG135 型電子天平（梅特勒—托利多儀器有限公司）；202-2 型電熱恒溫干燥箱（江蘇省通州市）；S205DU 型電子天平（梅特勒—托利多儀器有限公司）。

1.2 藥品

阿魏酸（中國(guó)食品藥品檢定研究所，110773-201614，含量以99.0%計(jì)）；補(bǔ)骨脂素（中國(guó)食品藥品檢定研究所，110739-201617，含量以99.70%計(jì)）；甲醇、乙腈；蔗糖、乳糖、甘露醇、微晶纖維素、甜菊素（購(gòu)自南寧市越前食品添加劑有限責(zé)任公司)。五指毛桃、當(dāng)歸、田七、麥冬、川芎、木瓜藥材均采購(gòu)于廣西仙茱中藥科技有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠質(zhì)量保證部檢驗(yàn)合格。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝的優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以加水量（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）作為考察因素，以提取液中得膏率、阿魏酸和補(bǔ)骨脂素的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，運(yùn)用L9（34）設(shè)計(jì)補(bǔ)噓養(yǎng)勒顆粒提取工藝的優(yōu)化篩選。實(shí)驗(yàn)因素水平，見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2.2 HPLC法測(cè)定補(bǔ)噓養(yǎng)勒顆粒處方提取液中阿魏酸、補(bǔ)骨脂素的含量

2.2.1 供試品溶液的制備 按照處方量稱取各藥材，加入8倍水量浸泡30 min，煎煮3次，60 min/次，200 目濾布過(guò)濾，濃縮成清膏，定容至250 mL，備用。取清膏5.0 mL，加70%甲醇定容至25 mL，超聲提取40 min，放冷，補(bǔ)液，濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)微孔濾膜（0.22 μm），即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取阿魏酸、補(bǔ)骨脂素適量，加入適量70%甲醇溶解，使阿魏酸濃度為18.31 μg/mL、補(bǔ)骨脂素濃度為9.70 μgmL。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按補(bǔ)噓養(yǎng)勒顆粒處方比例稱取缺五指毛桃、川芎和當(dāng)歸的藥材，分別按處方工藝提取，再按“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.4 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)色譜條件 色譜柱為Shim-pack GIST（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～7 min，20%A；25 min，40%A；30 min，50%A；40 min，90%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：244 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算不低于3 000，按補(bǔ)骨脂素計(jì)算不低于3 000。補(bǔ)噓養(yǎng)勒顆粒提取液色譜圖，見(jiàn)圖1。

圖1 補(bǔ)噓養(yǎng)勒顆粒提取液色譜圖

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別將混標(biāo)母液稀釋成適量的濃度，按上述色譜條件測(cè)定，以峰面積為橫坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣濃度為縱坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，阿魏酸回歸方程為Y=30192X-1454.7，R2=0.999 9，阿魏酸在3.66～21.97 μg/mL 的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；補(bǔ)骨脂素回歸方程為Y=70 503X-3 048.4，R2=0.999 9，補(bǔ)骨脂素在1.94～11.64 μg/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混標(biāo)溶液，按色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次。阿魏酸RSD值為1.95%，補(bǔ)骨脂素RSD 值為1.90%，均小于2%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 按色譜條件測(cè)定。阿魏酸RSD值為1.95%，補(bǔ)骨脂素RSD值為1.90%，均小于2%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樣品在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取清膏，按照“2.2.1”項(xiàng)制備6份供試品溶液并按色譜條件測(cè)定，阿魏酸RSD值為1.79%、補(bǔ)骨脂素RSD 值為1.79%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密量取已知含量的供試品適量，按照1∶0.5、1∶1、1∶1.5 的比例加入混標(biāo)溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下提取并按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿魏酸的平均回收率為99.40%，RSD 值為2.83%，補(bǔ)骨脂素的平均回收率為100.53%，RSD值為2.91%。

2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)正交因素水平表設(shè)計(jì)L9（34）試驗(yàn)，按照“2.1.2”項(xiàng)建立的方法測(cè)定供試品溶液中阿魏酸、補(bǔ)骨脂素的含量以及得膏率。以得膏率的含量（X1）加權(quán)系數(shù)設(shè)為0.2，每個(gè)處方中阿魏酸（X2）、補(bǔ)骨脂素（X3）的含量指標(biāo)加權(quán)系數(shù)設(shè)為0.4，綜合評(píng)分（Y）=（0.2X1+0.4X2=0.4X3）。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果，見(jiàn) 表2、表3。由方差結(jié)果可知，水煎煮提取工藝實(shí)驗(yàn)各因素對(duì)中影響提取次數(shù)＞加水量＞提取時(shí)間，只有提取次數(shù)對(duì)考察指標(biāo)有顯著性差異，結(jié)合直觀分析結(jié)果綜合考慮，確定最佳提取工藝為A3B1C3，即加入10倍水量，提取3次，提取時(shí)間為30 min。

表2 L9（34）水提工藝正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果表

表3 方差分析結(jié)果表

按照處方量稱取各藥材，平行制備3份，按優(yōu)選提取工藝參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定得膏率為3.61%、每個(gè)處方量中含有24.04 mg 阿魏酸和11.34 mg 補(bǔ)骨脂素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該提取工藝基本穩(wěn)定可行。

2.4 成型工藝研究

2.4.1 輔料的選擇 按最佳提取工藝得到的藥液，經(jīng)濃縮、干燥得浸膏粉，根據(jù)表4的比例將輔料與浸膏粉混勻后制成顆粒的收率、溶化性及口感來(lái)選擇恰當(dāng)輔料，結(jié)果見(jiàn)表5。顆粒收率的測(cè)定：將制備好的顆粒稱重。顆粒收率=合格顆粒重量（g）/[浸膏粉重量（g）+輔料重量(g)]×100%。溶化性的測(cè)定：在干燥恒重的5 mL離心管中加入精密稱定的顆粒，精密加入沸水5 mL，攪拌振蕩5 min，3 000 r/min 離心15 min，棄去上清液，在80 ℃將殘?jiān)娓芍梁阒?，精密稱定，計(jì)算溶化率。溶化率=溶化顆粒質(zhì)量/顆粒質(zhì)量×100%?？诟械燃?jí)：苦味較重、味甜而微苦。根據(jù)輔料篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定輔料為蔗糖。

表4 輔料篩選實(shí)驗(yàn)

表5 輔料篩選結(jié)果

2.4.2 成型工藝的選擇

根據(jù)影響成型工藝過(guò)程中存在的諸多因素，考慮乙醇濃度、乙醇用量和攪拌時(shí)間設(shè)計(jì)了因素水平及L9(34)正交試驗(yàn)表，見(jiàn)表6、表7。以顆粒收率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。根據(jù)方差分析結(jié)果可知，3 個(gè)因素對(duì)顆粒收率的影響程度大小依次為A＞B＞C，且因素A、B 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表8。根據(jù)直觀分析結(jié)果確定最佳工藝為A2B2C3，經(jīng)重復(fù)最佳工藝條件A2B2C3試驗(yàn)，得到顆粒收率與正交表試驗(yàn)結(jié)果基本一致，故確定成型工藝為乙醇濃度75%，乙醇用量8%，攪拌15 min。

表6 因素水平表

表7 L9(34)正交試驗(yàn)表

表8 方差分析結(jié)果

2.5 顆粒成型工藝的評(píng)價(jià)

按最佳提取、成型工藝制備3批樣品，進(jìn)行顆粒成型工藝評(píng)價(jià)。

2.5.1 粒度的測(cè)定 按照《中國(guó)藥典》2015年版第四部粒度和粒度分布測(cè)定法（通則0982第二法雙篩分法)測(cè)定粒度。3批樣品的粒度比例分別為14.27%、11.62%、12.30%，平均值為12.73%。試驗(yàn)結(jié)果表明，未通過(guò)一號(hào)篩和通過(guò)五號(hào)篩的顆粒及粉末占顆粒的12.73%，＜15%，符合規(guī)定。

2.5.2 水分的測(cè)定 按照《中國(guó)藥典》2015 年版第一部（附錄XH）水分測(cè)定法第一法（烘干法）測(cè)定供試品中含水量（%）。3批樣品的水分檢測(cè)結(jié)果分別為5.18%、5.63%、4.79%，平均值為5.20%。試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品水分的在4.8%～5.7%之間，小于8%，符合規(guī)定。

2.5.3 溶化性的考察 取本品10 g，加熱水200 mL，攪拌5 min，立即觀察，顆粒全部溶化有輕微渾濁，符合規(guī)定。

2.6 中試資料

按篩選出的處方工藝放大100倍進(jìn)行中試3批，其批號(hào)分別為20200701、20200702、20200703。每批按照1∶100 比例稱取原料。加10 倍量水提取3 次，30 min/次，過(guò)濾，濾液濃縮至相對(duì)密度1.10～1.15（80 ℃）的清膏，加入乙醇使含醇量達(dá)70%，攪拌，靜置12 h，濾過(guò)，濾液濃縮成稠膏，干燥，粉碎過(guò)100目篩，加入蔗糖粉及乙醇，混合均勻，制成顆粒，干燥，總混機(jī)混合均勻，分裝，包裝，分別對(duì)所得顆粒樣品的顆粒收率、粒度和溶化性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，3批中試的顆粒收率分別為95.40%、95.20%、94.40%，粒度為12.41%、13.18%、12.73%，溶化性均良好。

3 討論

補(bǔ)噓養(yǎng)勒方是由五指毛桃、當(dāng)歸、田七、麥冬、川芎、木瓜組成的。主藥中的五指毛桃又名南芪、五爪龍、五指牛奶，為?？浦参锎秩~榕的干燥根。經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，五指毛桃中富含補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、芹菜素等[8-9]。其中，補(bǔ)骨脂素的含量是五指毛桃主要質(zhì)量控制指標(biāo)[10-12]。當(dāng)歸，別名干歸、秦哪等，是最常用的中藥之一，具有補(bǔ)氣益血，調(diào)經(jīng)止痛，潤(rùn)燥滑腸的功效。目前的研究對(duì)當(dāng)歸的質(zhì)量控制等相關(guān)研究不勝枚舉，當(dāng)歸中含有洋川芎內(nèi)酯、阿魏酸、阿魏醛、藁本內(nèi)酯等[13-14]。阿魏酸的含量是控制當(dāng)歸質(zhì)量的重要指標(biāo)[15-17]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)噓養(yǎng)勒提取液中含有補(bǔ)骨脂素、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯等，其中補(bǔ)骨脂素、阿魏酸的含量較高，結(jié)合方中主藥的化學(xué)成分研究理論基礎(chǔ)，以補(bǔ)骨脂素、阿魏酸含量作為補(bǔ)噓養(yǎng)勒方的質(zhì)控指標(biāo)。

課題組建立了補(bǔ)噓養(yǎng)勒顆粒提取液中阿魏酸、補(bǔ)骨脂素的含量測(cè)定方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿魏酸在3.66～21.97 μg/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=30192X-1454.7（R2=0.999 9），補(bǔ)骨脂素在1.94～11.64 μg/mL 的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系回歸方程為Y=70503X-3048.4（R2=0.999 9），平均加樣回收率分別為99.40、100.53%，精密度、穩(wěn)定性等試驗(yàn)均符合相關(guān)要求。此外，為了驗(yàn)證制定的含量測(cè)定方法的耐用性，課題組還分別考察了30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇不同溶媒對(duì)提取液中阿魏酸、補(bǔ)骨脂素含量的影響，結(jié)果顯示，70%甲醇具有較好的提取效果；考察了不同流動(dòng)相（乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈－水）、不同流速（0.5 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min）的分離效果，綜合阿魏酸、補(bǔ)骨脂素含量的結(jié)果及相應(yīng)色譜峰的分離度等，最終確定以乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相，以1.0 mL/min作為實(shí)驗(yàn)條件的流速下。并運(yùn)用該色譜條件在不同的色譜柱上進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，該色譜條件運(yùn)用在不同廠家的色譜柱[Agilent ZORBAX SB-C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Shim-pack GIST（250 mm×4.6 mm，5 μm）]上，阿魏酸和補(bǔ)骨脂素均具有較好的分離效果。

通過(guò)正交試驗(yàn)，以得膏率、活性成分阿魏酸、補(bǔ)骨脂素的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化提取條件，通過(guò)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，確定最佳提取工藝：加入10倍水量，提取3次，提取時(shí)間為60 min；常用的中藥顆粒劑的稀釋劑、主要有蔗糖、糊精、淀粉、乳糖、甘露醇、微晶纖維素等[18]，結(jié)合前期課題組的預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，選擇乳糖、微晶纖維素、甘露醇、甜菊素、蔗糖作為輔料進(jìn)行考察。通過(guò)顆粒收率、溶化率及口感結(jié)果，確定蔗糖作為補(bǔ)噓養(yǎng)勒顆粒的輔料，并以顆粒收率評(píng)價(jià)乙醇濃度，加入量以及攪拌時(shí)間對(duì)成型工藝的影響，確定最佳成型工藝為：75%乙醇濃度，乙醇用量8%，攪拌15 min。

本研究建立的補(bǔ)噓養(yǎng)勒顆粒提取物阿魏酸、補(bǔ)骨脂素的含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、靈敏、可靠、重現(xiàn)性好；優(yōu)選的最佳的提取工藝條件、成型工藝條件穩(wěn)定可行，為后期的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。