外感二號合劑中葫蘆素B的鑒別和含量測定*

藍曉步，植國繁，許崇搖，黃興振，吳 瑞，盧文汐，秦艷娥Δ

（1.廣西南寧市第一人民醫(yī)院，南寧 530022；2.廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧 530022）

外感二號合劑是山芝麻、鴨腳木、白點稱（崗梅）等多味藥材組成的醫(yī)療機構(gòu)制劑。該合劑為南寧市第一人民醫(yī)院老中醫(yī)根據(jù)廣西南寧的地域和氣候特點而研制的驗方，經(jīng)制劑室科學(xué)配制而成的純中藥制劑，取得批準(zhǔn)文號（桂衛(wèi)藥制字［1999］010067）并用于臨床。該合劑在院內(nèi)臨床應(yīng)用已有多年，經(jīng)臨床驗證治療外感風(fēng)熱所致的發(fā)熱、咽炎、支氣管炎等有明顯療效，具有清熱解毒、解表利咽的功效[1]。石玲東等[2]通過臨床觀察研究發(fā)現(xiàn)，運用苦柏洗劑聯(lián)合外感二號合劑治療普通型小兒手足口病具有顯著療效，對患兒口腔皰疹具有一定的治療作用，可促進病情恢復(fù)。方中山芝麻為君藥之一，收載于《廣西壯藥標(biāo)準(zhǔn)》第一卷[3]，性苦寒，味辛且苦，具有解表清熱、解毒消腫功效[4]。為有效地控制外感二號合劑的質(zhì)量，本實驗通過研究建立了以山芝麻中葫蘆素B為指標(biāo)的薄層色譜（TLC）鑒別及高效液相色譜（HPLC）含量測定方法，該方法可以作為外感二號合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之一。

1 材料與方法

1.1 儀器

ZF-8型四用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ULUP-I-10 型超純水機（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；XS-205DU型十萬分之一電子天平。

1.2 試劑

葫蘆素B對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111945-201301）；外感二號合劑（南寧市第一人民醫(yī)院自制，批號分別為191101，200401，210101，規(guī)格為每瓶100 mL）；海洋牌硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠，批號20181216）；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑為分析純，超純水（自制）。

1.3 TLC鑒別

1.3.1 條件 薄層色譜填料以硅膠G 為吸附劑，展開劑[5]：甲苯—乙酸乙酯—冰醋酸（7∶2∶1），溫度28 °C，濕度40%，噴顯色劑10%硫酸乙醇溶液后，105°C加熱后置于365 nm紫外燈下檢視。

1.3.2 溶液的制備（1）供試品：取本品10 mL，加入60%乙醇40 mL，加熱回流1 h。過濾，置水浴中蒸干蒸干。殘渣加10 mL蒸餾水溶解。再用乙酸乙酯萃取2次，每次30 mL。合并萃取液，置水浴中蒸干，殘渣加甲醇1 mL 溶解，作為供試品溶液。（2）對照品[6]：精密稱取葫蘆素B適量，加甲醇溶解，定容，并稀釋成每1 mL 含葫蘆素B 1 mg 的對照品溶液。（3）對照藥材：稱取山芝麻對照藥材約5 g，依法制備對照藥材溶液。（4）陰性樣品：按處方制成缺山芝麻的陰性樣品溶液。取相當(dāng)于供試品量，依法制成陰性樣品溶液。

1.3.3 點樣、展開、顯色 按照薄層色譜法[7]試驗，分別吸取葫蘆素B 對照品、供試品溶液、對照藥材溶液、陰性樣品溶液各5 μL點于同一塊硅膠G預(yù)制板上，以甲苯—乙酸乙酯—冰醋酸（7∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴顯色劑10%硫酸乙醇溶液后105°C加熱15 min 后置于365 nm 紫外燈下檢視。外感二號合劑供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾，見圖1。

2 HPLC 含量測定方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為JADE-PAK ODS-AQ（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相[8]為乙腈-0.1%醋酸（46∶54，v/v）。流速定為1.0 mL/min，檢測波長設(shè)為228 nm[9-12]，注溫為室溫，進樣量設(shè)為10 μL。

2.2 溶液的制備

（1）對照品溶液的制備：精密稱取葫蘆素B 適量，加甲醇溶解，定容，并稀釋成每1 mL含葫蘆素B 1 mg 的對照品溶液[6]。（2）供試品溶液的制備：精密量取本品30 mL，加入60%乙醇適量，加熱回流1 h，過濾，濾液蒸干，加適量蒸餾水溶解。再用乙酸乙酯萃取2 次，每次30 mL。合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇適量，轉(zhuǎn)移置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試溶液。（3）陰性樣品溶液的制備：按外感二號合劑處方比例，除不加入山芝麻藥材外，依法制成缺山芝麻藥材的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

分別取對照品溶液、供試溶液及陰性樣品溶液，按擬定色譜條件進樣10 μL，進行系統(tǒng)適用性試驗，記錄色譜圖。與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對稱因子為0.98，理論塔板數(shù)按葫蘆素B 計不低于5 000，見圖2。通過色譜圖對比，供試品中葫蘆素B的色譜峰與對照品色譜峰的保留時間基本一致，且陰性樣品在對應(yīng)的位置上無色譜峰干擾。

圖2 HPLC圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取葫蘆素B 對照品，甲醇溶解，定容，配置成濃度為0.01 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.40 mg/mL、0.60 mg/mL、0.80 mg/mL、1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按擬定色譜條件進行測定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得葫蘆素B的回歸方程為Y=13 042 172.64X－59 373.34，r=0.999 9。葫蘆素B 質(zhì)量濃度在0.01～1.00 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

取同一份對照品溶液，按擬定色譜條件分別連續(xù)進樣測定6次，記錄各峰面積，結(jié)果葫蘆素B色譜峰面積的RSD值為0.28%，表明儀器精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一批樣品（批號200401）配制的供試品溶液，按擬定色譜條件，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h進樣，記錄葫蘆素B吸收峰的峰面積，結(jié)果葫蘆素B色譜峰面積的RSD值為0.61%（n=6），表明供試品的穩(wěn)定性較好。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批次樣品（批號200401）6 份，同法制備供試品溶液，按擬定色譜條件平行測定6 次。結(jié)果葫蘆素B的RSD值為0.72%，表明方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的外感二號合劑（批號200401）6 份，每份15 mL，每份精密加入相同量的葫蘆素B，同法制備供試品溶液，按擬定色譜條件分別進樣測定，計算葫蘆素B 的平均回收率。葫蘆素B 的平均回收率為99.49%（RSD=1.77%，n=6），見表1。

表1 葫蘆素B的加樣回收率試驗結(jié)果 n=6

2.9 樣品含量測定

分別取3 個批號外感二號合劑各2 份，同法制備供試品溶液。按擬定色譜條件進樣測定，每份樣品測定2 次，計算外感二號合劑中葫蘆素B 的平均含量，見表2。

表2 外感二號合劑中葫蘆素B含量測定結(jié)果 n=2

3 討論

3.1 質(zhì)量評價指標(biāo)的選擇

由于外感二號合劑現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較低，僅有性狀檢查，缺乏TLC 鑒別和含量檢查，不符合現(xiàn)代中藥制劑的質(zhì)量管理要求，筆者擬通過本研究以提升該合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方中的山芝麻作為君藥之一，具有解清熱、消腫解毒等功效[4]。山芝麻臨床上多用于治療由風(fēng)熱感冒引起的癥狀，例如全身酸痛、鼻塞、咽喉紅腫熱痛、流涕、支氣管炎、發(fā)熱頭痛等[13-15]。本研究曾對山芝麻中齊墩果酸的含量開展了HPLC 方法測定相關(guān)成分含量的研究工作，但由于處方藥味較多，相互干擾太大，經(jīng)文獻研究[16-17]發(fā)現(xiàn)，該合劑中的鴨腳木皮和白點稱（崗梅）這兩味藥材成分均含有齊墩果酸成分。有文獻報道[18]，葫蘆素B 為山芝麻的主要有效成分之一，通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，葫蘆素B 在該合劑中可以區(qū)別于其他藥材的專屬性成分，故以葫蘆素B 作為外感二號合劑的質(zhì)量評價指標(biāo)，可作為特異性指標(biāo)控制外感二號合劑的質(zhì)量。

3.2 展開劑體系的摸索

TLC 實驗中，對環(huán)己烷—乙酸乙酯—甲酸（10:10:0.5）[19]和甲苯—乙酸乙酯—冰醋酸（7∶2∶1）[5]兩種展開劑系統(tǒng)進行了比較，相同條件下甲醇的提取效果最佳。甲苯—乙酸乙酯—冰醋酸（7∶2∶1）這一展開劑體系的色譜圖中斑點更清晰、分離度更好。故選取甲苯—乙酸乙酯—冰醋酸（7∶2∶1）作為展開劑。

3.3 流動相的選擇

參考文獻中[8]葫蘆科植物藥材中葫蘆素類成分的含量方法，曾選用乙腈-0.1%醋酸（49∶51，v/v）作為流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葫蘆素B和供試品的峰形不好，且拖尾嚴(yán)重。采用不同比例的乙腈-0.1%醋酸系統(tǒng)，對葫蘆素B對照品及樣品的出峰時間、理論板數(shù)、分離度和峰形等進行了比較。最終選擇了乙腈-0.1%醋酸（46∶54，v/v），其保留時間適合，分離度合格，比例拖尾情況較輕，理論塔板數(shù)按葫蘆素B 計不應(yīng)低于5 000。

3.4 色譜柱的選擇

曾采用Phenomenex Luna?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil 100-5C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、JADE-PAK ODS-AQ 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）等色譜柱分別進行樣品溶液的測定。以Phenomenex Luna?C18柱測得樣品溶液色譜圖中保留時間雖較良好，但其色譜峰形不好，因而沒有采用；而Kromasil 100-5C18柱測得的樣品溶液色譜圖中峰形比較差，故不予選用；JADE-PAK ODS-AQ色譜柱測得樣品溶液的葫蘆素B 保留時間適合，且與前后雜質(zhì)峰分離效果均良好，分離度均大于1.5，符合《中國藥典》的規(guī)定。

3.5 方法評價

本研究中首次對外感二號合劑中山芝麻中藥材的葫蘆素B 進行定性鑒別及含量測定，建立的方法具有簡便快捷、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高、專屬性強等特點，可作為外感二號合劑定性及定量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。