梓醇通過上調(diào)BMP-2表達激活Wnt/β-catenin信號通路促進大鼠股骨骨折愈合*

曹 園，陳楓文，胡 楊，廉 凱，張熙明

（湖北文理學院附屬醫(yī)院襄陽市中心醫(yī)院骨科，襄陽 441021）

骨骼在運動、支持器官、維持礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)和結構堅固性方面發(fā)揮著重要作用。代謝紊亂、創(chuàng)傷、腫瘤切除、骨髓炎手術清創(chuàng)以及各種先天性疾病均可造成骨萎縮、骨再生延遲等骨缺損[1]。據(jù)統(tǒng)計，骨折的終生患病率為50%。雖然大多數(shù)骨損傷能夠正常愈合，但仍有10%～15%的骨折患者會出現(xiàn)愈合不良的并發(fā)癥，如延遲愈合或不愈合[2]。因此，繼續(xù)探索促進骨折愈合的有效策略具有重要意義。地黃是東亞地區(qū)的一種傳統(tǒng)中草藥，已被廣泛用于治療骨質(zhì)疏松癥，但其活性成分和作用機制尚不完全清楚[3]。梓醇是地黃的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗缺血等多種生物學活性[4]。然而，梓醇對骨折愈合的影響尚待闡明。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，在促進和加速骨再生方面具有巨大潛力[5]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）是骨形成最重要的調(diào)節(jié)因子之一，自人體胚胎發(fā)育開始參與骨骼發(fā)育和骨缺損修復，在脂肪、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起著至關重要的作用[6]。已有研究表明，BMP-2通過激活人無翅型MMTV整合位點家族（Wingless-Type MMTV Integration Site Family，Wnt）信號通路，使β-連鎖蛋白（β-catenin）信號通路積聚，從而促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化，修復骨缺損[7]。本研究旨在探究梓醇對大鼠股骨骨折愈合的影響及其作用機制是否與調(diào)控BMP-2 和Wnt/β-catenin 信號通路相關，以期為制定新的促進骨折愈合的有效策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品和主要試劑

梓醇（純度≥98%）購自成都曼思特生物科技有限公司；BMP-2干擾慢病毒液（sh-BMP-2）和陰性對照慢病毒液（sh-NC）購自上海吉瑪制藥技術有限公司；Trizol 試劑購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix 購自美國Bimake ；BMP-2、Runx2 和Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）抗體購自英國Abcam；β-catenin 和GAPDH 抗體購自北京義翹神州科技股份有限公司；cyclinD1 和c-myc抗體購自美國Cell Signaling Technology ；堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒和BCA 蛋白定量檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；骨鈣素（OCN）檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

48 只清潔級雄性SD 大鼠，6～7 周齡，體質(zhì)量（230±20）g，購自湖北奧菲生物科技有限公司，許可證號SCXK（鄂）2019—0024。所有大鼠飼養(yǎng)于標準動物房。環(huán)境溫度20～24 ℃、濕度60%～70%、晝夜12 h/12 h 飼養(yǎng)，提供充足的飲水和飼料。待所有大鼠適應環(huán)境1 周后，進行造模。本研究經(jīng)我院動物實驗倫理委員會審批通過。

1.3 方法

1.3.1 大鼠股骨骨折模型的建立及給藥處理

待所有大鼠適應環(huán)境1 周后，參考文獻[8]建立大鼠股骨骨折模型。10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉大鼠，隨后將大鼠固定。暴露大鼠股骨中段，用線鋸將股骨中段鋸斷，造成橫行骨折。用直徑為1.5 mm的克氏針進行髓內(nèi)固定骨折斷端，生理鹽水反復沖洗切口后，逐層縫合切口。將48 只SD 大鼠隨機分為對照組、梓醇組、梓醇+sh-NC 組和梓醇+sh-BMP-2 組，每組12 只。梓醇組大鼠灌胃50 mg/kg梓醇[9]，梓醇+sh-NC組大鼠灌胃50 mg/kg梓醇和尾靜脈注射300 μL sh-NC 慢病毒液，梓醇+sh-BMP-2 組大鼠灌胃50 mg/kg 梓醇和尾靜脈注射300 μL sh-BMP-2 慢病毒液，對照組大鼠灌胃等量溶劑，1次/d，連續(xù)給藥3周。

1.3.2 X線檢測

各組大鼠骨折0 周、2 周和3 周后，拍攝各組大鼠股骨正位X 線片。參考文獻[10]應用Lane-Sandhu X 線評分評估各組大鼠骨折愈合情況。Lane-Sandhu X線評分標準包括骨形成、骨連接、骨塑形3個方面。骨形成：無骨形成記0分；骨形成占骨缺損25%記1 分；骨形成占骨缺損50%記2 分；骨形成占骨缺損75%記3分；骨形成滿缺損記4分。骨連接：骨折線清楚記0分；骨折線部分存在記2分；骨折線消失記4分。骨塑形：未見骨塑形記0分；骨髓腔形成記2分；皮質(zhì)骨塑形記4分。

1.3.3 Micro-CT檢測

術后2 周和3 周，各組大鼠隨機取6 只大鼠，10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉大鼠，隨后處死大鼠，取患肢股骨標本，去除周圍軟組織和髓內(nèi)克氏針。用微型CT 系統(tǒng)掃描股骨，定義骨折線上下5 mm 范圍區(qū)域建立三維興趣區(qū)，分別測量骨體積（bone volume，BV）、骨體積分數(shù)（bone volume/tissue volume，BV/TV）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，TB.N）、骨小梁間距（trabecular bone spacing，TB.Sp）和骨小梁厚度（trabecular thickness，TB.Th）。

1.3.4 RT-PCR檢測BMP-2 mRNA表達

術后3 周，處死大鼠，取大鼠骨痂組織液氮凍存。取液氮凍存的各組大鼠骨痂組織，迅速研磨至粉末狀。加入Trizol 試劑，提取組織總RNA。微量分光光度計測定各樣品的RNA 濃度，立即將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以此cDNA 為模板，根據(jù)2×SYBR Green qPCR Master Mix 說明書所示進行BMP-2 mRNA 表達的檢測。反應程序：95℃、10 min；95℃、15 s，60℃、30 s，72℃、30 s，40 個循環(huán)；95℃、15 s；60℃、60 s；95℃、15 s。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算BMP-2 mRNA 表達。其中，BMP-2 上游引物：5’-TCGAGAACAGATG CAGGAAG-3’，BMP-2 下游引物：5’-GGAATTTCGAGT TGGCTGTT-3’；GAPDH 上游引物：5’-TTGAACCAGGCGGCTGCGGA-3’，GAPDH 下游引物：5’-GGAGGCTGCG GGCTCAATTT-3’。

1.3.5 Western blotting 檢測BMP-2、Runx2、ColⅠ、β-catenin、cyclinD1和c-myc蛋白表達

取液氮凍存的各組大鼠骨痂組織，迅速研磨至粉末狀。加入RIPA 蛋白裂解液，冰上裂解組織30 min，離心取上清液。BCA 蛋白定量檢測試劑盒測定上清液的蛋白濃度。各樣品取30 μg蛋白置于SDS-PAGE 凝膠加樣孔內(nèi)進行電泳分離和轉(zhuǎn)膜操作。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，隨后加入BMP-2（1∶1 000）、Runx2（1∶1 000）、ColⅠ（1∶1 000）、βcatenin（1∶1 000）、cyclinD1（1∶2 000）、c-myc（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）抗體，4 ℃條件下孵育過夜。二抗（1∶5 000）室溫條件下孵育1 h。將ECL化學發(fā)光檢測試劑均勻滴至膜上，化學發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶。應用Image Pro Plus 6.0軟件進行蛋白條帶的灰度分析。

1.3.6 ELISA檢測血清中ALP和OCN水平

10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉大鼠，分離患肢側股動脈，切斷股動脈后收集血液。血液室溫靜置10 min后，離心收集上清液（即血清）。根據(jù)ELISA 檢測試劑盒說明書所示，檢測血清樣品中ALP和OCN水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠骨折愈合X線評分的比較

與對照組比較，梓醇組大鼠骨折2周和3周后X線評分顯著升高（P＜0.05）；梓醇組和梓醇+sh-NC組大鼠骨折2周和3周后X線評分差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與梓醇+sh-NC 組比較，梓醇+sh-BMP-2組大鼠骨折2周和3周后X線評分顯著降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠骨折愈合X線評分的比較

2.2 各組大鼠Micro-CT檢測指標的比較

與對照組相比，梓醇組大鼠骨折3周后BV、BV/TV、TB.N 和TB.Th 顯著升高（P＜0.05），TB.Sp 無顯著差異（P＞0.05）；梓醇組和梓醇+sh-NC 組大鼠骨折3 周后BV、BV/TV、TB.N、TB.Sp 和TB.Th 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與梓醇+sh-NC 組相比，梓醇+sh-BMP-2組大鼠骨折3周后BV、BV/TV、TB.N和TB.Th 顯著降低（P＜0.05），TB.Sp 無顯著差異（P＞0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠Micro-CT檢測指標的比較

2.3 各組大鼠BMP-2蛋白表達的比較

與對照組相比，梓醇組大鼠BMP-2 mRNA和蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；梓醇組和梓醇+sh-NC組大鼠BMP-2 mRNA 和蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與梓醇+sh-NC 組相比，梓醇+sh-BMP-2 組大鼠BMP-2 mRNA 和蛋白表達明顯降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠BMP-2蛋白表達

2.4 各組大鼠血清骨代謝指標和成骨相關基因蛋白表達的比較

與對照組相比，梓醇組大鼠ALP 和OCN 水平顯著升高（P＜0.05），Runx2 和ColⅠ蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；梓醇組和梓醇+sh-NC 組大鼠ALP和OCN 水平、Runx2 和ColⅠ蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與梓醇+sh-NC組相比，梓醇+sh-BMP-2組大鼠ALP和OCN水平顯著降低（P＜0.05），Runx2和ColⅠ蛋白表達顯著降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組大鼠血清骨代謝指標和成骨相關基因蛋白表達的比較

2.5 各組大鼠Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白表達的比較

與對照組相比，梓醇組大鼠β-catenin、cyclinD1和c-myc蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；梓醇組和梓醇+sh-NC 組大鼠β-catenin、cyclinD1 和c-myc 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與梓醇+sh-NC組相比，梓醇+sh-BMP-2組大鼠β-catenin、cyclinD1和c-myc蛋白表達顯著降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組大鼠Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達的比較

3 討論

骨折愈合是一個復雜、緩慢、長期的病理過程，涉及間充質(zhì)干細胞的趨化和聚集，成骨細胞的分化和成熟，以及細胞外基質(zhì)的形成和血管生成[11]。骨折愈合是受損組織的自我修復過程，但各種因素的干預可能會減緩愈合過程或?qū)е鹿遣贿B[12]。目前，關于梓醇對骨折的作用及其可能的作用機制尚不明確。本研究結果表明，梓醇通過上調(diào)BMP-2表達激活Wnt/β-catenin 信號通路在大鼠股骨骨折愈合過程中起促進作用。

梓醇具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和降血糖等多種生物活性[13]。研究表明，梓醇通過抑制核因子κB配體誘導的破骨細胞形成和骨吸收，抑制卵巢切除小鼠的骨丟失。該結果表明，梓醇可能是治療骨疾病的一種有前途的候選藥物[14]。另有研究探討了梓醇對牙槽骨損傷的保護機制，該研究結果顯示，梓醇能減少骨丟失，升高ALP和OCN水平，降低TNFα 和COX-2 的表達，從而減輕尼古丁所致?lián)p傷和牙槽骨丟失，促進牙槽骨礦化[15]。本研究結果顯示，梓醇可升高大鼠X 線評分、BV、BV/TV、TB.N 和TB.Th，升高大鼠ALP 和OCN 水平，促進骨痂形成、Runx2和ColⅠ蛋白表達，該研究結果與Li等[15]的研究結果一致，說明梓醇可促進大鼠骨折端軟骨痂的礦化和吸收，促進骨折愈合。

BMP-2 是調(diào)節(jié)成骨細胞分化的最重要的細胞因子之一，在胚胎發(fā)生、細胞生長、分化到骨發(fā)育和骨折修復等多種細胞功能中發(fā)揮相關作用。成人骨骼中BMP活性的變化與骨質(zhì)疏松癥、骨關節(jié)炎和骨折愈合能力下降有關[16]。證據(jù)顯示，BMP-2 能促進體外兔骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖和成骨分化。此外，BMP-2 能促進兔橈骨缺損處的骨修復[17]。研究表明，BMP-2聯(lián)合骨誘導生物陶瓷材料β-磷酸三鈣可明顯促進拔牙窩骨愈合，減少拔牙窩骨壞死[18]。在體外，丹參酮ⅡA 通過上調(diào)BMP-2 增加Runx2 和ColⅠ的表達、ALP 活性和鈣沉積，促進小鼠胚胎成骨細胞前體細胞的成骨分化。在體內(nèi)，丹參酮ⅡA具有促進骨折愈合的作用。該研究結果表明，上調(diào)BMP-2在骨折愈合中具有重要作用[19]。本研究結果顯示，梓醇治療可上調(diào)股骨骨折大鼠BMP-2蛋白表達。此外，慢病毒介導的BMP-2干擾可逆轉(zhuǎn)梓醇對骨折大鼠骨折愈合的促進作用。結果表明，梓醇通過上調(diào)BMP-2表達促進大鼠骨折愈合。

Wnt/β-catenin信號通路在間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞、軟骨細胞或成骨細胞分化過程中起著關鍵作用[20]。β-Catenin 的活性受Wnt 信號轉(zhuǎn)導的控制，由Wnt配體、Fzd和Lrp5/6組成的復合物可穩(wěn)定細胞質(zhì)β-Catenin 蛋白并阻止其降解。累積的β-catenin 轉(zhuǎn)運到細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子LEF/TCF 形成復合物，刺激下游基因c-myc、cyclinD1 和c-jun 的表達[21]。βcatenin 的缺失將使間充質(zhì)干細胞的成骨分化轉(zhuǎn)變?yōu)檐浌巧蒣20]。目前，已有研究表明，DMP-PYT 通過增強BMP-2誘導的β-catenin的活化，在體內(nèi)外刺激成骨細胞分化和骨形成[22]。此外，證據(jù)顯示，梓醇在體內(nèi)外通過激活Wnt/β-catenin 信號通路誘導骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化，增加大鼠顱骨缺損模型中骨愈合能力，并減輕卵巢切除模型大鼠骨丟失[23]。因此，梓醇對骨折大鼠的作用可能與調(diào)控BMP-2 和Wnt/β-catenin 信號通路有關。本研究結果顯示，梓醇處理可上調(diào)Wnt/β-catenin 信號通路中β-catenin、c-myc 和cyclinD1 表達。慢病毒介導的BMP-2干擾可逆轉(zhuǎn)梓醇對骨折大鼠β-catenin、c-myc和cyclinD1 表達的促進作用。該研究結果表明，梓醇可能通過上調(diào)BMP-2 表達激活Wnt/β-catenin 信號通路促進大鼠股骨骨折愈合。

綜上所述，梓醇可能通過上調(diào)BMP-2表達激活Wnt/β-catenin信號通路促進大鼠股骨骨折愈合。本研究為明確梓醇對骨折愈合的影響及開發(fā)新的骨折治療藥物提供了新的依據(jù)。