低溫常壓等離子體改善牙本質(zhì)-全酸蝕粘接系統(tǒng)粘接效果的體外研究

王欽鴻 王丹楊 謝娜 唐成芳 李子夏 王路明

[摘要]目的：本研究擬觀測低溫常壓等離子體射流處理對牙本質(zhì)-全酸蝕粘接系統(tǒng)粘接效果及牙本質(zhì)膠原纖維耐NaClO降解的效果。方法：離體牙去除牙合面牙釉質(zhì)，暴露的牙本質(zhì)打磨后酸蝕15s并沖洗，隨后用NTAPP射流分別處理牙面0、5、10、15、20s，常規(guī)制作微拉伸粘接試件，每組有一半試件冷熱循環(huán)10 000次，分別檢測各組循環(huán)前后牙本質(zhì)粘接強(qiáng)度。獲取中層牙本質(zhì)片，酸蝕后經(jīng)NTAPP處理0、5、10、15、20s后，分別浸泡于5% NaClO溶液中0、30、60、120s，掃描電鏡觀察各組脫礦牙本質(zhì)膠原的降解情況。對各組粘接強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：所有NTAPP處理組的微拉伸粘結(jié)強(qiáng)度（Micro-tensile bond strength，?TBS）值均顯著高于對照組;NTAPP處理5s組的?TBS值顯著高于其他組;老化后NTAPP處理5s和10s組的?TBS值顯著高于其他各組。掃描電鏡觀察脫礦膠原顯示，隨著NaClO溶液處理時(shí)間延長，各組牙本質(zhì)膠原均呈現(xiàn)不同程度降解，對照組120s膠原完全消失，但NTAPP處理組仍可見膠原纖維殘留。NTAPP處理5和10s經(jīng)NaClO浸泡30s后，膠原纖維網(wǎng)結(jié)構(gòu)完整。NTAPP處理15和20s，使部分膠原纖維凝結(jié)變性。結(jié)論：采用合適的參數(shù)及處理時(shí)間，NTAPP可有效保護(hù)牙本質(zhì)膠原纖維并提高牙本質(zhì)-全酸蝕粘接界面的耐久性。

[關(guān)鍵詞]等離子體;牙本質(zhì);微拉伸粘接強(qiáng)度;粘接持久性;膠原;全酸蝕粘接劑

[中圖分類號(hào)]R783? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2021）07-0093-04

In Vitro Study of Non-thermal Atmospheric Pressure Plasma in Improving the Bonding Effect of Dentin with an Etch-and-rinse System

WANG Qin-hong1，WANG Dan-yang1，XIE Na2，TANG Cheng-fang1，LI Zi-xia2，WANG Lu-ming3

（1.Department of Prosthodontics;2.Department of Oral Medicine，School of Stomatology，Xian Medical University，Xian 710021，Shaanxi，China;3.Department of Stomatology，the Second Affiliated Hospital of Xian Medical University，Xian 710038，Shaanxi，China）

Abstract： Objective? To evaluate the bonding effect of non-thermal atmospheric pressure plasma treatment on the dentin-adhesive interface with an etch-and-rinse system and the degradation resistance of collagen under the sodium hypochlorite （NaClO） challenge. Methods? The occlusal enamel of each tooth was removed. The exposed and polished dentin surface was etched for 15s and rinsed. The etched dentin surface was exposed to the plasma jet for 0， 5， 10， 15， 20s. Then the micro-tensile bonding specimens were made following the method described previously. Half of the specimens in each group were thermo-cycled 10 000 times. The micro-tensile bonding specimens from each tooth were subjected to μTBS testing. The dentin slabs of middle part from each tooth were treated with plasma jet for 0， 5， 10， 15， 20s after etched， and further immersed in 5% NaClO solution for different treatment times （0， 30， 60 and 120s）. All specimens were observed under FE-SEM. The results of μTBS were analyzed with SPSS. Results? The μTBS values of all NTAPP treatment groups were significantly increased compared with the control group. The T-5 group presented statistically higher μTBS values than any other groups. After thermocycling aging， the μTBS values of 5 and 10s groups were significantly higher than those of the other groups. Collagen fibrils presented with various levels of degradation in each group， with increasing NaClO treatment time. After NaClO treatment for 120s， the collagen fibrils of control group were completely degraded. However， residue collagen fibrils were still observed in the NTAPP treatment group. Collagen fibrils of 5 and 10s groups presented well-formed open networks after NaClO treatment for 30s. After NTAPP treatment for 15 and 20s， some demineralized collagen fibrils were melted and degenerated. Conclusion? Under optimal in vitro conditions， NTAPP treatment is effective in enhancing the dentin–bonding strength， improving the durability of the dentin–adhesive interface， and modifying the degradation resistance of collagen under NaClO challenge.

Keywords： non-thermal atmospheric pressure plasma; dentin; micro-tensile bond strength; bonding durability; collagen; the etch-and-rinse adhesive system

牙體組織與修復(fù)材料之間形成牢固且長效的粘接力對口腔粘接修復(fù)至關(guān)重要。牙本質(zhì)的粘接依賴于混合層結(jié)構(gòu)的形成[1]，但現(xiàn)有的全酸蝕粘接系統(tǒng)及自酸蝕粘接系統(tǒng)會(huì)在混合層底部形成缺陷帶及納米滲漏，使部分牙本質(zhì)膠原失去粘接劑的保護(hù)作用而裸露，易受到水分以及各種蛋白水解酶的作用發(fā)生降解，引起牙本質(zhì)粘接界面的退變[2-5]。因而，如何有效提高牙本質(zhì)膠原纖維交聯(lián)度，減少膠原裸露，是改善牙本質(zhì)粘接界面耐久性的主要手段。低溫常壓等離子體（Non-thermal atmospheric pressure plasma，NTAPP）是近年來一種新興的表面處理技術(shù)，可以產(chǎn)生大量帶電粒子、各種離子、自由基、活性氧等活性物質(zhì)，并且在能量轉(zhuǎn)換時(shí)對周圍環(huán)境的加熱作用較弱，因此可保持較低溫度，使得等離子體技術(shù)可以應(yīng)用于熱敏感性較高的生物組織[6]。已有研究表明[7]，NTAPP處理可以改變牙本質(zhì)表面理化性能，提高牙本質(zhì)即刻粘接強(qiáng)度。有學(xué)者推測NTAPP處理可使膠原纖維的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[7]，但這種改變是否能夠增加膠原的交聯(lián)度提升其生物力學(xué)強(qiáng)度，從而改善牙本質(zhì)粘接界面耐久性，目前尚不明確。本研究擬探討NTAPP處理牙本質(zhì)后，對其粘接持久性、膠原耐降解性的影響，以期為NTAPP在口腔粘接領(lǐng)域的應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1 主要儀器：萬能材料試驗(yàn)機(jī)（Shimadzu公司，日本），場發(fā)射掃描電鏡（field emission scanning electron microscope，F(xiàn)E-SEM，JSM-7500F，Jeol，日本），光固化機(jī)（Dentsply公司，美國），37℃水浴恒溫箱（上海方瑞儀器有限公司），低速金剛石切割機(jī)（沈陽科晶自動(dòng)化設(shè)備制造有限公司），低溫常壓等離子體發(fā)生裝置（CTP-2000K，南京蘇曼等離子科技有限公司），示波器（MSO1104Z，蘇州普源精電科技有限公司），齒科冷熱循環(huán)機(jī)（西安世紀(jì)測控技術(shù)研究所）。

1.2 主要試劑和材料：Single Bond 2全酸蝕粘接劑、Filtek Z250復(fù)合樹脂（3M公司，美國），37%磷酸酸蝕劑（Vericom 公司，韓國），高純度氦氣（99.999%，西安天盛氣體有限公司），去離子水。

收集新鮮無齲的第三磨牙（西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院口腔科），患者知情同意，刮除附著軟組織，清洗后生理鹽水中4℃保存，于1周內(nèi)使用。本研究由西安醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審查通過，批準(zhǔn)號(hào)為XYLS2020142，患者均簽署知情同意書。

1.3 微拉伸粘接強(qiáng)度測試

1.3.1 NTAPP射流產(chǎn)生：本研究使用的NTAPP設(shè)備采用連續(xù)正弦波驅(qū)動(dòng)的介質(zhì)阻擋放電原理，電源輸入功率為8W，峰值電壓Vpp為7.0kV，頻率為54.9kHz，放電氣體為高純度氦氣（He），氣體流量為4L/min。

1.3.2 牙本質(zhì)微拉伸粘接試件的制備：60顆新鮮離體牙用慢速切割機(jī)在流水降溫條件下，暴露咬合面牙本質(zhì)，600目碳化硅砂紙研磨60s，預(yù)備出統(tǒng)一的粘接面玷污層，超聲清洗5min。采用隨機(jī)數(shù)字表法，根據(jù)NTAPP處理時(shí)間的不同5、10、15、20s以及是否進(jìn)行老化處理隨機(jī)分10組（n=6），以未預(yù)處理組作為陰性對照組。

牙本質(zhì)表面用37%的磷酸凝膠酸蝕15s，流水沖洗60s，無塵紙巾吸干試件表面水分后置于NTAPP噴嘴下方3cm處，按照分組使NTAPP射流均勻噴刷牙面。使用無塵紙巾蘸取蒸餾水潤濕牙面15s，濕棉球蘸干多余水分，按照Single Bond 2說明書涂布兩遍粘接劑，進(jìn)行常規(guī)樹脂粘接。將粘接試件浸入37℃蒸餾水中24h。

1.3.3 試件老化處理及微拉伸粘接強(qiáng)度測試：未老化組牙齒用慢速切割機(jī)于流水冷卻下順牙齒長軸、垂直于粘接界面片切，制備用于微拉伸粘接強(qiáng)度測試的條狀試樣（0.8mm×0.8mm×8.0mm）。粘接試件分別用502膠固定于測試臺(tái)上，用萬能測試機(jī)（精度為0.02N）以1.0mm/min的加載速度進(jìn)行測試，直至試件斷裂，記錄粘接界面拉斷時(shí)的載荷，根據(jù)公式計(jì)算：微拉伸強(qiáng)度（MPa）=斷裂載荷（N）/試件截面積（mm2）。將來自同一顆牙的粘接試件的粘接強(qiáng)度求均值作為一獨(dú)立樣本，然后結(jié)合同一組內(nèi)來自其他牙齒粘接試件的均值一起獲得每組的粘接強(qiáng)度均值與標(biāo)準(zhǔn)差。

老化組牙齒固定于冷熱循環(huán)試驗(yàn)機(jī)上，在5℃和55℃環(huán)境中進(jìn)行循環(huán)，每次停留60s，循環(huán)10 000次取出進(jìn)行微拉伸測試，方法同前。

1.4 牙本質(zhì)膠原耐次氯酸鈉溶解作用的檢測

1.4.1 試件制備：流水沖洗下，27顆新鮮離體牙用慢速切割機(jī)去除咬合面釉質(zhì)層，截取冠部牙本質(zhì)，每顆牙可制取3片1.5×1.5×6mm3大小的牙本質(zhì)片，每個(gè)牙片背面刻兩道刻痕以區(qū)分試件正反面。80個(gè)試件隨機(jī)分為5組（n=16）。牙本質(zhì)片正面酸蝕、NTAPP處理方式同1.3.2。隨后各組牙本質(zhì)片分別浸泡于3.5ml 5%濃度的NaClO溶液中0、30、60、120s（n=4），然后流水下沖洗4h。

1.4.2 膠原顯微形貌觀察：將處理后的牙本質(zhì)試件，用2.5%戊二醛0.1mol/L、pH7.2的PBS固定4h，PBS沖洗3次，乙醇梯度脫水，真空干燥、噴金，在FE-SEM下觀察脫礦牙本質(zhì)膠原的超微結(jié)構(gòu)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用K-S檢驗(yàn)證實(shí)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn)后，對?TBS 進(jìn)行雙因素方差分析（影響因素：等離子體處理、老化處理）。對同一老化條件下?TBS進(jìn)行單因素方差分析，Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。對同組老化前后的?TBS進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2? 結(jié)果

2.1 微拉伸強(qiáng)度：各組?TBS結(jié)果見圖1。等離子體和老化處理均對粘接強(qiáng)度有顯著影響（P<0.001），且兩者間交互作用顯著（P<0.05）。老化前，各NTAPP處理組?TBS顯著高于對照組（P<0.05），以NTAPP處理5s組粘接強(qiáng)度最高（55.63±1.81）MPa。老化后，NTAPP處理5和10s組?TBS稍有降低，與老化前相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），并顯著高于其他各組（P<0.05）。老化后，對照組、NTAPP處理15、20s組?TBS顯著降低（P<0.05），但15、20s組粘接強(qiáng)度仍顯著高于對照組（P<0.05）。

2.2 NaClO溶解后各組膠原纖維形貌：由圖2可見，隨著NaClO處理時(shí)間延長，各組膠原纖維網(wǎng)均出現(xiàn)不同程度降解現(xiàn)象。對照組未經(jīng)NaClO處理前，牙本質(zhì)小管間、管周及小管內(nèi)膠原纖維網(wǎng)完整（見圖2A）。經(jīng)NaClO處理30s后，管周和小管內(nèi)部膠原纖維網(wǎng)仍可保持完整性，但管間膠原纖維降解（見圖2B）。經(jīng)NaClO處理60s后，膠原纖維降解現(xiàn)象加劇，僅某些小管內(nèi)可見單根完整的膠原纖維（見圖2C）。經(jīng)NaClO處理120s后，膠原纖維完全降解，牙本質(zhì)小管口開放呈較大的漏斗狀，根管壁可見側(cè)支開口（見圖2D）。

NTAPP處理5、10s組經(jīng)NaClO處理30s后，膠原纖維網(wǎng)形貌與未經(jīng)NaClO處理的對照組相似，無明顯改變（見圖2E～F）。經(jīng)NaClO處理60s后，管周和小管內(nèi)膠原纖維網(wǎng)結(jié)構(gòu)仍較完整（見圖2G）。經(jīng)NaClO處理120s后，膠原纖維進(jìn)一步降解，未降解的膠原纖維出現(xiàn)斷裂和卷曲現(xiàn)象（見圖2H）。

NTAPP處理15、20s組未經(jīng)NaClO處理前，小管口上方可見片狀膠原凝集物（見圖2I）。經(jīng)NaClO處理30、60s后，管內(nèi)膠原纖維斷裂并顯著減少，小管口仍可見片狀膠原凝集物（見圖2J～K）。經(jīng)NaClO處理120s后，僅可觀測到少量片狀膠原凝集物位于小管口上方（見圖2L）。

3? 討論

等離子體是繼氣體、液體和固體之后的第四種物質(zhì)形態(tài)，是氣體在高頻高壓電場作用下，得到的一種呈電中性并具備高電離度的氣體團(tuán)。包含帶電粒子、各種離子、自由基、活性氧、紫外線、可見光等大量活性物質(zhì)[8-9]。由于氣體流溫度較高，應(yīng)用受限。低溫常壓等離子體可保持較低溫，使得等離子體技術(shù)能夠應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。目前，NTAPP在口腔醫(yī)療領(lǐng)域的研究包括滅菌、修復(fù)材料表面改性、牙齒美白、牙周治療及口腔粘接技術(shù)[10-13]。其中，滅菌及材料改性受溫度影響較低，后三種研究方向因涉及到牙髓、細(xì)胞及膠原等生物組織，對NTAPP的溫度累積作用異常敏感，限制了NTAPP在該領(lǐng)域的應(yīng)用研究，亟需探索適合的放電參數(shù)。

本研究的微拉伸粘接強(qiáng)度測試結(jié)果顯示，等離子體處理可以顯著提高牙本質(zhì)與全酸蝕粘接系統(tǒng)的即刻粘接強(qiáng)度，并維持較穩(wěn)定的粘接持久性，這與以往研究結(jié)果基本一致[7，14-15]。其具體機(jī)制與以下方面相關(guān)：①等離子體處理可以改善牙本質(zhì)表面的親水性和潤濕性，降低牙本質(zhì)表面接觸角，從而提高粘接劑在牙本質(zhì)粘接界面的滲透性[13，16];②等離子體處理可以向膠原纖維引入羧基或羰基等官能團(tuán)[7，14，17]，牙本質(zhì)表面羰基含量的增加可提高膠原纖維與粘接劑之間氫鍵的相互作用;③羰基數(shù)目增加產(chǎn)生的電斥力使膠原纖維暫時(shí)脫聚成更小的纖維聚集體，甚至單個(gè)纖維，提高了粘接劑對膠原纖維的滲透[7];④等離子體的抗菌作用發(fā)揮一定功效[12]，牙體預(yù)備后殘留的細(xì)菌可在牙本質(zhì)粘接界面存活兩年之久，經(jīng)等離子體處理可降低粘接界面微生物介導(dǎo)的降解。

膠原耐降解結(jié)果顯示，對照組經(jīng)NaClO浸泡后膠原纖維的降解程度較NTAPP處理組顯著，提示NTAPP處理可改善牙本質(zhì)膠原纖維的強(qiáng)度，這可能與等離子體介導(dǎo)的交聯(lián)作用相關(guān)。等離子體產(chǎn)生的紫外線可引起明膠分子間交聯(lián)，并在膠原和明膠氨基酸（如酪氨酸和苯丙氨酸）的芳香殘基上形成自由基[18]。其次，等離子體產(chǎn)生的自由基可與OH相互作用，在聚合纖維上形成羥基化合物，隨后可通過氫鍵增加交聯(lián)數(shù)量[19]。此外，等離子體中的電子也與基質(zhì)相互作用，在聚合物鏈中形成自由基，引發(fā)聚合鏈中瞬間形成自由基，進(jìn)而啟動(dòng)交聯(lián)過程[20]。

NTAPP處理具有雙重效用，在適宜的參數(shù)下，可有效增加牙本質(zhì)粘接強(qiáng)度、持久性及膠原的機(jī)械強(qiáng)度，而處理牙本質(zhì)時(shí)間過長會(huì)降低粘接強(qiáng)度，并改變脫礦牙本質(zhì)的微觀形貌。脫礦的牙本質(zhì)膠原纖維會(huì)在40℃左右發(fā)生變性[21-22]，NTAPP處理15和20s可見膠原凝結(jié)成片狀，提示這兩組的熱量累積破壞了脫礦的膠原纖維，NTAPP產(chǎn)生的高能粒子及氣體流量對脫礦膠原也存在一定影響。這兩組?TBS在老化前后的變化也印證了NTAPP的負(fù)面作用。

在適宜條件下，NTAPP處理可有效提高牙本質(zhì)粘接強(qiáng)度，改善牙本質(zhì)與全酸蝕粘接劑（Single Bond 2）的粘接持久性，增強(qiáng)脫礦膠原纖維耐NaClO溶解的能力。本研究中，最適宜的處理時(shí)間是5s。而NTAPP處理對牙本質(zhì)膠原纖維交聯(lián)作用的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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[收稿日期]2021-01-26

本文引用格式：王欽鴻，王丹楊，謝娜，等.低溫常壓等離子體改善牙本質(zhì)-全酸蝕粘接系統(tǒng)粘接效果的體外研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2021，30（7）：93-97.