補腎活血祛痰方對高雄激素多囊卵巢綜合征大鼠類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)因子的影響

周 楊，彭 聰，柯淑紅，葉正華，劉亞琪

(1.武漢市第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北 武漢 430000；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢430065)

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovarian syndrome,PCOS)是臨床常見的一種婦科疾病，其具有不能治愈、疾病進展性等特點[1-3]。目前西醫(yī)上主要采用藥物和手術(shù)對PCOS進行治療，其中藥物主要為達英-35，雖然其療效理想，但長期服藥會引起糖耐量不足，乃至加重高胰島素血癥[4]。手術(shù)治療創(chuàng)傷大，術(shù)后易發(fā)生并發(fā)癥，患者接受度并不高。我國傳統(tǒng)中醫(yī)治療PCOS療效理想，且不良反應(yīng)較少，被臨床較廣泛應(yīng)用[5]。本文選擇PCOS大鼠為模型，根據(jù)其發(fā)病機制，探討補腎活血祛痰方對高雄激素PCOS大鼠卵巢組織中類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein,StAR)的影響，以期為PCOS的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：選用21日齡的SPF級雌性健康小鼠,動物批準號：SCXK(京)2020-0009,60只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，常規(guī)飼養(yǎng)于清潔級實驗室中[室溫(22±2)°C]。

1.1.2 藥物：脫氫表雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)；補腎活血祛痰方：生山楂30 g，枸杞子20 g，煅瓦楞子、當(dāng)歸各15 g，山茱萸、黃芩各9 g，經(jīng)過水煎、過濾及濃縮成含生藥1.0 g/ml濃度藥液，-4 ℃保存待用。

1.1.3 主要試劑與儀器：黃體生成激素(Luteinizing hormone，LH)試劑盒、睪酮(Testosterone，T)試劑盒、StAR及GAPDH一抗、二抗、Western blot及凝膠電泳試劑；切片機、酶標檢測儀、離心機、顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組方法：將60只大鼠隨機分為對照組和中藥組，各30只。

1.2.2 造模和給藥：所有大鼠采用DHEA注射建立PCOS模型，每日注射DHEA，劑量：6 mg/100 g體重，同時注射0.2 ml油劑，連續(xù)20 d；第11天，采用陰道脫落細胞涂片檢查2個性周期(每周期為5 d)，當(dāng)持續(xù)出現(xiàn)陰道上皮基底層細胞，且陰道角化細胞未曾出現(xiàn)，陰道脫落細胞失去完整動情周期，則判定造模成功。造模成功后，中藥組給予補腎活血祛痰方治療：補腎活血祛痰方灌胃，1次/d，每次劑量為25 mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃22 d，對照組給予等量的0.9 %氯化鈉溶液灌胃。

1.2.3 標本采集：末次給藥后，大鼠禁食過夜，第2天水合氯醛(10%)麻醉，采集其眼眶后靜脈血，離心機離心10 min(2500 r/min)，收集血清，-80 ℃超低溫冰箱保存，采用頸椎脫臼法處死大鼠，取其卵巢，常規(guī)固定和脫水后，石蠟包埋切片。

1.3 觀察項目及方法

1.3.1 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察：石蠟包埋切片進行HE染色，將切片放置入Harris蘇木素染中5 min，給予蘇木素染細胞核；然后切片置入伊紅染液中染色3 min，酒精梯度脫水，然后中性樹膠封片，鏡下觀察各組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)情況，包括卵泡、黃體、顆粒細胞的變化情況。

1.3.2 血清激素及炎癥水平測定：采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清中LH、T、胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和腫瘤壞死因子(TNF-α)表達水平，嚴格按照說明書進行操作，酶標儀讀取OD值(15 min內(nèi))，并計算出LH、T、IGF-Ⅰ和TNF-α水平。

1.3.3 Western blot檢測StAR蛋白表達：改良異硫氰酸胍法提取總蛋白，然后測定蛋白濃度(Bradford比色法)，調(diào)整各組蛋白濃度，保持一致，變性處理，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)印后，置入封閉液中搖動孵育1 h，加入一抗(1∶1000稀釋)孵育，4 ℃下過夜。二抗(1∶2000稀釋)孵育2 h，免疫熒光增強法顯色，StAR蛋白的表達量與GAPDH的灰度比值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠卵巢組織形態(tài)情況 見表1(圖1)。HE染色結(jié)果顯示，對照組卵泡呈囊性擴張，囊狀卵泡內(nèi)卵母細胞消失，可見多個空卵泡，顆粒細胞排列極為紊亂；中藥組可見少數(shù)囊泡細胞，可見到少數(shù)初級卵母細胞、次級卵母細胞、生長卵泡以及成熟卵泡，顆粒細胞數(shù)目較對照組增多，卵泡的顆粒細胞層次多，且排列較規(guī)則，治療22 d后，中藥組的卵泡及黃體數(shù)明顯多于對照組(均P<0.05)。

圖1 兩組大鼠卵巢組織形態(tài)(HE染色,×200)

表1 兩組大鼠卵泡數(shù)及黃體數(shù)(個)

2.2 兩組大鼠血清激素水平比較 見表2。治療22 d后，中藥組血清LH和T水平比對照組明顯降低(均P<0.05)。

表2 兩組大鼠血清激素水平比較

2.3 兩組大鼠血清IGF-Ⅰ和TNF-α水平比較 見表3。治療22 d后，中藥組血清IGF-Ⅰ和TNF-α水平比對照組明顯降低(均P<0.05)。

表3 兩組大鼠血清IGF-Ⅰ和TNF-α水平比較

2.4 兩組大鼠卵巢組織中StAR蛋白的表達情況比較 見圖2。Western blot結(jié)果顯示，治療22 d后，中藥組卵巢組織中StAR蛋白表達(0.483±0.027)明顯比對照組(0.837±0.035)降低(P<0.05)。

1、2為對照組；3、4為中藥組

3 討 論

PCOS是女性最常見的一種機體代謝紊亂性疾病，以高雄激素血癥、脂代謝紊亂及高胰島素血癥為特征，會引起患者閉經(jīng)、激素水平異常增高及不孕癥狀[6-7]。PCOS的發(fā)病機制目前尚未完全清楚，內(nèi)分泌失調(diào)、胰島素抵抗等因素均可導(dǎo)致其發(fā)病[8-9]。高雄激素血癥會阻礙PCOS患者卵泡成熟，使卵泡閉鎖，導(dǎo)致發(fā)生囊性病變[10]。PCOS在我國傳統(tǒng)中醫(yī)中屬于“閉經(jīng)”“癥瘕”“不孕”“崩漏”范疇，認為其發(fā)病機制為，患者腎精虧虛、腎氣虛衰導(dǎo)致排卵稀發(fā)或不排卵，腎虛日久導(dǎo)致任脈不通、沖脈不足，經(jīng)血不能匯集下注胞宮，導(dǎo)致月經(jīng)后期，甚至閉經(jīng)[11]。因此治療以補腎為主，兼活血化瘀，祛濕除痰[12]。

卵巢是女性儲備卵子及產(chǎn)生激素的生殖器官，卵泡是其最基本功能單位，承擔(dān)著儲備營養(yǎng)物質(zhì)與傳遞遺傳物質(zhì)的作用[13]。補腎活血祛痰方由生山楂、枸杞子、煅瓦楞子、當(dāng)歸、山茱萸、黃芩組成。其中生山楂具有活血化瘀、消食化積的功效；枸杞子具有滋補肝腎、明目潤肺的效果；煅瓦楞子可起到化瘀散結(jié)、消痰軟堅的作用；當(dāng)歸具有補血活血調(diào)經(jīng)的功效；山茱萸具有澀精固脫、補肝腎的功效；黃芩具有瀉火解毒、清熱燥濕的作用，以上諸藥共用，可起到補腎活血、祛痰利濕的效果[14-15]。本研究將其用于PCOS大鼠身上，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥治療22 d后，中藥組卵泡顆粒細胞數(shù)目較對照組增多，卵泡的顆粒細胞層次多，且排列較規(guī)則，卵泡及黃體數(shù)明顯多于對照組，這說明了補腎活血祛痰方可明顯促進大鼠卵泡的發(fā)育，誘發(fā)排卵，改善黃體形成，并改善卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而改善卵巢的生殖功能。

高雄激素血癥可以引起機體下丘腦-垂體-卵巢軸功能發(fā)生紊亂，導(dǎo)致LH水平升高，使高雄激素的活性增強，促進PCOS患者的卵巢分泌雄激素，加重高雄激素血癥[16-17]?，F(xiàn)代藥理學(xué)認為[18-19]，山楂、當(dāng)歸這些活血化瘀藥中的有效成分可改善微循環(huán)，增加血流量，改善組織供養(yǎng)；枸杞子等補腎類藥物可調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸功能，起到類雌激素樣作用。StAR是一種甾體類生成快速調(diào)節(jié)蛋白，其在甾體激素產(chǎn)生的過程中起到關(guān)鍵作用，對調(diào)控血清激素水平有著重要作用[20]。當(dāng)IGF-Ⅰ水平異常升高時，IGF-Ⅰ的類似胰島素功能也發(fā)生變化，機體新陳代謝異常、雄激素水平上升，增加胰島素抵抗，導(dǎo)致PCOS發(fā)生。TNF-α是重要的促炎細胞因子之一，且在PCOS的患者中表達增高。本研究結(jié)果顯示，治療后，中藥組血清LH和T水平比對照組明顯降低，中藥組StAR蛋白表達明顯比對照組降低，這可能是因為通過補腎活血祛痰方治療，可增強卵巢局部血液循環(huán)，增進其血流量，改善胰島素抵抗，調(diào)控血清激素水平，減輕胰島素抵抗；通過改善卵巢局部環(huán)境，影響StAR和類固醇激素及其合成酶的合成，下調(diào)StAR蛋白的表達。

綜上所述，補腎活血祛痰方可有效降低高雄激素PCOS大鼠血清激素水平，下調(diào)StAR蛋白的表達，改善卵巢功能，可為臨床治療PCOS提供一定的實驗依據(jù)。