利塞膦酸鈉對(duì)去勢(shì)大鼠骨折愈合的影響△

何立江，黃杰苗，吳俊哲，柯呈輝，吳文華

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院脊柱骨科，福建泉州 362046）

隨著我國(guó)逐漸步入老年化社會(huì)，老年性骨質(zhì)疏松癥及其并發(fā)癥越來(lái)越受到重視。國(guó)外權(quán)威機(jī)構(gòu)調(diào)查顯示全球大約有2 億人患有輕重不一的骨質(zhì)疏松癥，該病現(xiàn)已成為全球多發(fā)病、常見(jiàn)病的第6 位［1］。由于骨礦物質(zhì)含量減少、骨骼強(qiáng)度降低和骨的脆性增加，患者極易發(fā)生骨折，具有極高的致殘率和致死率，盡快提高患者骨密度和骨礦物質(zhì)含量，促進(jìn)骨折愈合避免出現(xiàn)二次骨折顯得尤為重要，因此骨質(zhì)疏松癥性骨折的治療已成為當(dāng)今研究的熱門(mén)課題［2，3］。

二膦酸鹽類(lèi)藥物（bisphosphonates,BPs）是當(dāng)前治療骨質(zhì)疏松的重要手段，也是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，利塞膦酸鈉是其中的代表藥物，其主要通過(guò)抑制破骨細(xì)胞活性對(duì)骨骼代謝產(chǎn)生作用，雖有學(xué)者擔(dān)心此類(lèi)藥物會(huì)影響骨的重建，進(jìn)而對(duì)骨折的愈合過(guò)程造成影響［4］，但多數(shù)研究表明骨質(zhì)疏松骨折術(shù)后應(yīng)用該類(lèi)藥物可以提升患者骨折處的骨骼骨量，降低再骨折的發(fā)生率，可作為沒(méi)有禁忌證的老年骨質(zhì)疏松患者的首選藥物［5］。

目前對(duì)于骨折術(shù)后應(yīng)用二膦酸鹽類(lèi)藥物的最佳時(shí)間尚無(wú)定論，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討術(shù)后不同時(shí)間應(yīng)用利塞膦酸鈉對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型大鼠股骨骨折愈合的影響，為臨床應(yīng)用二膦酸鹽類(lèi)藥物時(shí)機(jī)選擇提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

90 只健康6 個(gè)月齡雌性Sprague-Dawley （SD）大鼠，體重（232.07±16.25）g，由閩侯吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第910 醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心分組籠養(yǎng)，室溫控制在（24±2）°C，專人喂養(yǎng)，自由飲水。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每周稱重并記錄，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R 使用原則給予照護(hù)。隨機(jī)分為3 組，每組30 只。

1.2 去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型

大鼠按300 mg/kg 的10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，由背側(cè)入路，于脊柱旁開(kāi)1 ㎝、髂骨脊上2 ㎝處為手術(shù)切口，切口長(zhǎng)1 ㎝，分離肌層顯露卵巢，切除卵巢并縫扎殘端，逐層關(guān)閉切口。術(shù)后3 d 肌注青霉素80 萬(wàn)單位，2 次/d。卵巢切除術(shù)后第4 周，各組分別處死10 只，檢測(cè)股骨骨密度確定制備骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型成功，并測(cè)量骨折建模前股骨力學(xué)指標(biāo)。

1.3 骨折模型建立與藥物處理

卵巢切除去勢(shì)手術(shù)4 周后，對(duì)3 組大鼠同樣麻醉狀態(tài)下，選取左股骨中段為手術(shù)切口，切口長(zhǎng)1 cm，顯露出股骨并截?cái)喙晒?，以直?.5 mm 鋼針經(jīng)髓腔固定斷端，逐層縫合各層組織。嚴(yán)格無(wú)菌手術(shù)操作，術(shù)后3 d 肌注青霉素80 萬(wàn)單位，2 次/d。

3 組動(dòng)物分別于骨折模型建立術(shù)后1 d、10 d 和20 d 開(kāi)始給予利塞膦酸鈉灌胃，0.1 mg/（kg·d），持續(xù)至處死動(dòng)物。于骨折建模術(shù)后3 周和6 周，分別處死3 組各10 只動(dòng)物，取出左側(cè)股骨，行以下檢測(cè)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 骨礦檢測(cè)

所有股骨標(biāo)本置入雙能X 線吸收儀，測(cè)量各標(biāo)本骨密度值（bone mineral density,BMD）的變化。

1.4.2 影像學(xué)檢查與測(cè)量

將處死后所有大鼠股骨標(biāo)本于標(biāo)準(zhǔn)位拍攝X 線片，攝片參數(shù)41 kV，2.80 mAs，在PACS 系統(tǒng)分別觀察骨折閉合間隙，測(cè)量斷端骨皮質(zhì)厚度，觀察骨折愈合和內(nèi)固定改變等情況。

1.4.3 組織學(xué)檢查與評(píng)分

3 組各10 個(gè)股骨標(biāo)本，經(jīng)固定、脫鈣、脫水、浸蠟制備蠟塊，切制3 μm 的切片，行HE 染色。4×10 倍光鏡視野下，計(jì)數(shù)軟骨細(xì)胞數(shù)，觀察骨痂處骨小梁、骨樣組織等。

1.4.4 生物力學(xué)檢查3 組各10 個(gè)股骨標(biāo)本行力學(xué)測(cè)試。采用4 點(diǎn)彎曲力學(xué)檢測(cè)方法，標(biāo)本底端固定，固定支點(diǎn)跨距20 mm，頂端加壓支點(diǎn)跨距8 mm，保持標(biāo)本濕潤(rùn)狀態(tài)下單軸側(cè)向加壓至標(biāo)本斷裂，加載速度1 mm/min，繪制載荷-位移曲線，記錄股骨骨痂處最大抗折彎載荷。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，資料呈正態(tài)分布時(shí)，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。資料呈非正態(tài)分布時(shí)，采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 骨礦檢測(cè)結(jié)果

三組動(dòng)物骨密度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。隨時(shí)間推移，1 d 組BMD 均持續(xù)顯著增加（P<0.05）；相比之下，10 d 組和20 d 組的BMD 呈曲線改變，骨折后3 周時(shí)下降至谷底，骨折后6 周時(shí)再次升高，不同時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。骨折前，三組間的BMD 的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），骨折3 周時(shí)，1 d 組和10 d 組BMD 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但兩組均高于20 d 組（P<0.05）；骨折6 周時(shí)，BMD由高至低依次為：1 d 組>10 d 組>20 d 組，三組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 三組大鼠骨折前后骨密度檢測(cè)結(jié)果（±s）與比較

表1 三組大鼠骨折前后骨密度檢測(cè)結(jié)果（±s）與比較

指標(biāo)BMD 值（g/cm2）P 值0.376<0.001<0.001時(shí)間點(diǎn)骨折前骨折后3 周骨折后6 周P 值1 d 組（n=10）0.119±0.007 0.124±0.006 0.280±0.030<0.001 10 d 組（n=10）0.122±0.005 0.119±0.004 0.213±0.020<0.001 20 d 組（n=10）0.121±0.004 0.114±0.006 0.123±0.005<0.001

2.2 影像和組織形態(tài)觀察與計(jì)量

三組骨折后6 周典型影像改變見(jiàn)圖1，可見(jiàn)1 d組內(nèi)固定物無(wú)移位松動(dòng)，骨折愈合良好（圖1a）；10 d 組骨折愈合，骨痂生長(zhǎng)良好（圖1b）；20 d 組骨折處骨痂生長(zhǎng)，但骨皮質(zhì)較顯單?。▓D1c）。

圖1 骨折后6 周三組大鼠股骨X 線檢查所見(jiàn) 1a: 1 d 組骨折愈合良好 1b: 10 d 組骨折愈合，骨痂生長(zhǎng)良好 1c: 20 d 組斷端骨痂生長(zhǎng)，但骨皮質(zhì)較顯單薄

三組骨折后6 周骨折端典型組織學(xué)改變見(jiàn)圖2， 可見(jiàn)1 d 組的骨小梁較豐富，骨細(xì)胞數(shù)量多（圖2a）；10 d 組骨小梁結(jié)構(gòu)清晰，骨細(xì)胞數(shù)較多（圖2b）；20 d 組骨小梁較稀疏，連續(xù)性較差，相比前兩組骨細(xì)胞數(shù)目少（圖2c）。

圖2 骨折后6 周三組大鼠股骨骨折端組織學(xué)所見(jiàn)（HE，4×10） 2a: 1 d 組可見(jiàn)骨小梁較密集，骨細(xì)胞數(shù)量多 2b: 10 d組骨小梁連續(xù)性較好，骨細(xì)胞數(shù)較多 2c: 20 d 組骨小梁稀疏，連續(xù)性較差，骨細(xì)胞數(shù)目較少

兩組形態(tài)計(jì)量結(jié)果見(jiàn)表2。與骨折后3 周相比，骨折后6 周時(shí)，3 組大鼠骨折端骨皮質(zhì)厚度均有增厚，骨折后3 周、6 周時(shí)，1 d 組、10 d 組兩組間骨皮質(zhì)厚度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但兩組骨皮質(zhì)厚度較20d 組有顯著增加（P<0.05）；此外與骨折后3 周相比，骨折后6 周時(shí)，3 組大鼠標(biāo)本40 倍視野下骨細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），3周、6 周時(shí)，1 d 組、10 d 組兩組間細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但均較20 d 組有顯著增加（P<0.05）。

表2 三組大鼠骨折端形態(tài)計(jì)量結(jié)果（±s）與比較

表2 三組大鼠骨折端形態(tài)計(jì)量結(jié)果（±s）與比較

指標(biāo)影像測(cè)量骨皮質(zhì)厚度（mm，n=10）骨折后3 周骨折后6 周P 值4×10 視野骨細(xì)胞計(jì)數(shù)（個(gè)，n=10）骨折后3 周骨折后6 周P 值1 d 組10 d 組20 d 組P 值<0.001 0.033 0.35±0.04 0.53±0.06<0.001 0.32±0.03 0.52±0.07<0.001 0.24±0.03 0.46±0.04<0.001<0.001 0.046 350.30±39.19 326.60±39.03 0.192 340.9±38.23 323.50±39.96 0.333 275.4±37.11 285.70±36.88 0.541

2.3 力學(xué)測(cè)試結(jié)果

三組力學(xué)測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3。隨時(shí)間推移，三組股骨標(biāo)本的最大載荷均顯著下降（P<0.05）；骨折前，三組間最大載荷的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，骨折后3 周、6 周，1 d 組、10 d 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），10 d 組、20 d 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但1 d 組最大載荷高于20 d 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表3 三組股骨標(biāo)本最大載荷測(cè)量結(jié)果（N，±s）與比較

表3 三組股骨標(biāo)本最大載荷測(cè)量結(jié)果（N，±s）與比較

時(shí)間點(diǎn)骨折前骨折后3 周骨折后6 周P 值1 d 組（n=5）38.10±3.51 34.10±3.51 26.10±4.15<0.001 10 d 組（n=5）37.60±3.47 31.90±3.41 23.10±3.73<0.001 20 d 組（n=5）38.70±3.30 30.10±3.03 21.50±3.17<0.001 P 值0.774 0.040 0.031

3 討 論

本次實(shí)驗(yàn)三組大鼠均實(shí)現(xiàn)骨折愈合，表明在骨轉(zhuǎn)換中利塞膦酸鈉對(duì)成骨細(xì)胞活性未造成明顯干擾，不會(huì)造成骨折不愈合的不利影響，這與其他學(xué)者的觀點(diǎn)是相似的［6，7］。骨折術(shù)后第3 周時(shí)，1 d、10 d 兩組大鼠骨密度含量均高于尚且未使用利塞膦酸鈉的20 d 組，表明在骨折愈合早期利塞膦酸鈉有助于快速提升骨密度，其機(jī)理可能主要通過(guò)對(duì)破骨細(xì)胞直接發(fā)揮細(xì)胞毒性作用、干擾成熟破骨細(xì)胞的功能等方面發(fā)揮作用［8］。1 d、10 d 兩組大鼠分別相差10 d 后應(yīng)用利塞膦酸鈉，但具有相近的中短期療效，考慮為利塞膦酸鈉起效較快，短時(shí)間內(nèi)即能有效提高骨密度，故早期和偏早期使用該藥物具有較近似的效果，有對(duì)比研究亦表明利塞膦酸鈉能縮短骨質(zhì)疏松患者的骨折愈合時(shí)間［9］。

在骨折術(shù)后第6 周時(shí)，三組大鼠均實(shí)現(xiàn)股骨骨折愈合，未發(fā)生內(nèi)固定松動(dòng)和再骨折，相比其他種類(lèi)抗骨質(zhì)疏松藥物具有較高的安全性［10］。但X 線影像顯示1 d、10 d 兩組大鼠骨折愈合處的骨痂總體來(lái)說(shuō)相對(duì)更加厚實(shí)，骨皮質(zhì)也更顯粗厚，骨小梁數(shù)量較高也較密集，骨小梁相互之間連續(xù)性更好。病理切片顯示出相類(lèi)似的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分別從骨折早期和偏早期開(kāi)始應(yīng)用利塞膦酸鈉，在骨折愈合過(guò)程的中期時(shí)，其增加骨密度的效果是相近的，但在骨折愈合晚期則表現(xiàn)出不同的療效，數(shù)據(jù)顯示三組大鼠股骨骨密度遠(yuǎn)期療效指標(biāo)間亦存在差異，較早使用利塞膦酸鈉也能更大程度提升骨折愈合時(shí)股骨最大載荷值等生物力學(xué)指標(biāo)。從另一個(gè)角度思考，是否利塞膦酸鈉在骨折愈合后期的作用隨著時(shí)間的推移而效果逐漸降低？結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，作者認(rèn)為利塞膦酸鈉對(duì)骨密度的提升趨勢(shì)是具有一定程度的時(shí)間依賴性的，即隨著時(shí)間的進(jìn)展其提升趨勢(shì)逐漸放緩。

做為具有較強(qiáng)藥物活性的二膦酸鹽類(lèi)藥物，利塞膦酸鈉在本次骨質(zhì)疏松骨折術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的應(yīng)用研究中，并未對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成骨折不愈合的不利影響，而且盡早應(yīng)用二膦酸鹽類(lèi)藥物能夠更快促進(jìn)骨折處鈣鹽的沉積，增加骨密度改善骨質(zhì)量，增強(qiáng)骨折愈合強(qiáng)度，能夠達(dá)到預(yù)防內(nèi)固定松動(dòng)和二次骨折發(fā)生的作用。當(dāng)然本實(shí)驗(yàn)也存在不足之處：首先本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)樣本不夠大，未能更細(xì)分時(shí)間點(diǎn)來(lái)對(duì)骨愈合指標(biāo)的提升曲線變化做更細(xì)致的相關(guān)性分析，其次，鑒于有報(bào)道長(zhǎng)時(shí)間使用二膦酸鹽類(lèi)藥物會(huì)增加非典型性股骨骨折風(fēng)險(xiǎn)［11］，因此對(duì)該類(lèi)藥物的安全有效用藥時(shí)間及對(duì)骨折愈合的遠(yuǎn)期效果，需要更長(zhǎng)時(shí)間跨度的進(jìn)一步研究。