HPLC法同時測定清肺排毒湯凍干物中2種黃酮類成分的含量

吳遠波 焦 濤

1.江西省醫(yī)學科學院，江西 南昌 330006；2. 遼寧省丹東市市場監(jiān)管事務服務中心藥檢部，遼寧 丹東 118002

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)自發(fā)生以來，由于其潛伏周期長、傳染性強、致病力強等特點[1]，在全國快速蔓延，給我國人民群眾的生命財產(chǎn)帶來巨大的損害。在新冠肺炎疫情早期沒有特效藥和疫苗的情況下，廣大中醫(yī)藥工作者認真總結中醫(yī)藥治療病毒性傳染病的規(guī)律和經(jīng)驗，篩選有效方劑，促進中醫(yī)藥深度介入新冠肺炎診療全過程[2]。國家中醫(yī)藥管理局組織實施應急科研專項，在河北、山西、黑龍江、陜西四省開展試點臨床觀察，結果顯示清肺排毒湯治療新型冠狀病毒感染的肺炎患者總有效率可達90%以上[3]。在此基礎上，國家衛(wèi)生健康委員會和國家中醫(yī)藥管理局在2020年2月通知，推薦各地在新型冠狀病毒感染肺炎治療時使用清肺排毒湯[4]。在隨后的新冠肺炎診療中，清肺排毒湯被廣泛使用，有效減緩病情發(fā)展，臨床療效明顯[5-8]。

鑒于清肺排毒湯在抗疫工作中展示的確切療效和重大研究成果，及其在今后常態(tài)化防疫工作中的潛在作用，研制可工業(yè)化生產(chǎn)、質量穩(wěn)定可控、使用方便的清肺排毒湯成方制劑將非常迫切。藥品質量研究是藥品研發(fā)工作的基礎和前提，對中藥成方中有效成分的含量控制是對成方質量控制的重要手段。清肺排毒湯出自《傷寒雜病論》中幾個經(jīng)典方劑，該藥處方由21味中藥組成，化學成分復雜，周嚴嚴等[9]基于UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術，鑒定推斷了清肺排毒湯中的87 個化合物，含43 個黃酮，9 個生物堿等，認為黃酮類和生物堿化合物是清肺排毒湯中的主要化合物。而橙皮苷和黃芩苷是清肺排毒湯藥味中含量較高的兩種黃酮類成分[10]，因此對橙皮苷和黃芩苷兩種黃酮類成分進行含量控制研究具有重要意義。查閱文獻發(fā)現(xiàn)橙皮苷和黃芩苷可以在同一條件下被檢識[11-12]。本研究通過方法學驗證，建立用HPLC法同時測定清肺排毒湯凍干物中橙皮苷和黃芩苷2種黃酮類成分含量的方法，實驗結果表明該方法簡便、準確可靠，可為清肺排毒湯成方制劑的開發(fā)奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 Thermo Scientific UltiMate 3000高效液相色譜儀(ThermoFisher公司，包括四元梯度泵，WPS-3000SL自動進樣器，TCC-3000RS柱溫箱，DAD-3000檢測器)；LGJ-10冷凍干燥機(四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展(北京)有限公司)；RE-52AA旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)； EX125ZH電子天平(奧豪斯儀器有限公司，感量0.01 mg)；FR124CN電子天平(奧豪斯儀器有限公司，感量0.1 mg)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；KQ-500E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 橙皮苷對照品(批號：110721-201818，含量以96.2%計)，購自中國食品藥品檢定研究院，黃芩苷對照品(批號：wkq20010908，含量以98.7%計)，購自四川省維克奇生物科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，磷酸、甲醇等其他試劑均為分析純。

中藥飲片如下：麻黃飲片(批號：200601)、炙甘草飲片(批號：200601)、苦杏仁飲片(批號：200601)、生石膏飲片(批號：200501)、桂枝飲片(批號：200601)、澤瀉飲片(批號：200601)、豬苓飲片(批號：200601)、白術飲片(批號：200601)、茯苓飲片(批號：200601)、柴胡飲片(批號：200701)、黃芩飲片(批號：200701)、姜半夏飲片(批號：200601)、生姜飲片(批號：200801)、紫菀飲片(批號：200601)、款冬花飲片(批號：200601)、射干飲片(批號：200601)、細辛飲片(批號：200601)、山藥飲片(批號：200601)、陳皮飲片(批號：200601)、廣藿香飲片(批號：200801)均購于江西匯仁堂藥品連鎖有限公司；枳實飲片(批號：200101)購于康美藥業(yè)股份有限公司。所有飲片均由丹東市市場監(jiān)管事務服務中心王鐵軍主任中藥師鑒定。

2 方法和結果

2.1 凍干物的制備 按清肺排毒湯處方：麻黃9 g，炙甘草6 g，苦杏仁9 g，生石膏30 g，桂枝9 g，澤瀉9 g，豬苓9 g，白術9 g，茯苓15 g，柴胡16 g，黃芩6 g，姜半夏9 g，生姜9 g，紫菀9 g，款冬花9 g，射干9 g，細辛6 g，山藥12 g，枳實6 g，陳皮6 g，廣藿香9 g[4]。稱取各飲片(共計211 g)，生石膏飲片加水240 mL先煎15 min，其余20 味加8 倍量水浸泡30 min，待生石膏煎煮好后，加入浸泡好的各飲片，煎煮30 min，用200 目不銹鋼篩網(wǎng)濾過，飲片再進行第2 次煎煮，加6 倍量水，煎煮30 min，用200 目不銹鋼篩網(wǎng)濾過，合并2 次的藥液。將藥液采用減壓濃縮的方法進行低溫濃縮，控制濃縮溫度不超過50 ℃，將水煎濾液體積濃縮至約400 mL。采用冷凍干燥的辦法進行干燥，將濃縮液至放置到冷凍干燥機的干燥盤中，再放置到冷凍干燥機上進行冷凍干燥，得到清肺排毒湯凍干物。

重復上述的操作方法，共制備3批清肺排毒湯凍干物，批號分別編為2008001、2008002、2008003，質量分別為41.68 g、42.07 g、41.71 g。

除黃芩外，按清肺排毒湯處方，稱取麻黃等20 味飲片，按上述制備方法制備，得到缺黃芩的陰性凍干物；除枳實和陳皮外，按清肺排毒湯處方，稱取麻黃等19 味飲片，按上述制備方法制備，得到缺枳實和陳皮的陰性凍干物。

2.2 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液(20：80)，檢測波長為283 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL·min-1；進樣量為10 μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 取橙皮苷、黃芩苷對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并制成含橙皮苷47.64 μg·mL-1、黃芩苷121.27 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取清肺排毒湯凍干物約0.5 g，置碾缽中研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，將錐形瓶密塞，稱定重量，超聲處理(功率500 W，頻率40 KHz)45 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.3 陰性樣品溶液的制備 取缺黃芩的陰性凍干物，按2.3.2項下供試品溶液制備項下的方法進行制備操作，制得缺黃芩的陰性樣品溶液；取缺枳實和陳皮的陰性凍干物，按2.3.2項下供試品溶液制備項下的方法進行制備操作，制得缺枳實和陳皮的陰性樣品溶液。

1.橙皮苷；2.黃芩苷A.對照品;B.供試品;C.缺黃芩陰性樣品;D.缺枳實和陳皮陰性樣品圖1 HPLC圖

2.4 系統(tǒng)適用性試驗 按2.2項下的色譜條件，分別取對照溶液、供試品溶液、缺黃芩的陰性樣品溶液、以及缺枳實和陳皮的陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品色譜圖中，橙皮苷和黃芩苷2種成分與相鄰的色譜峰之間的分離度均大于1.5。理論塔板數(shù)按橙皮苷峰計算不低于5000。缺黃芩的陰性樣品、缺枳實和陳皮的陰性樣品對待測成分的測定均無干擾。如圖1所示。

2.5 線性關系考察 精密吸取對照品溶液1、3、5、8、10、20 μL按2.2項下色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄橙皮苷和黃芩苷的峰面積，分別以對照品的進樣量(X，μg)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸，得到線性回歸方程：橙皮苷Y=25.9060X+0.5677(r=0.9993)、黃芩苷Y=49.1870X+0.0170(r=0.9994)。結果表明，橙皮苷的進樣量在0.04764～0.9528 μg，黃芩苷的進樣量在0.1213～2.425 μg范圍內與峰面積均有良好的線性關系。

2.6 精密度試驗 精密吸取2.3.1項下混合對照品溶液10 μL，按2.2項下的色譜條件，連續(xù)進行6 次的進樣測定，記錄橙皮苷和黃芩苷的峰面積。按峰面積計算，橙皮苷的RSD為0.4%，黃芩苷峰的RSD為0.7%，結果表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗 取同一批次的清肺排毒湯凍干物樣品(批號：2008003)，按2.3.2項下的方法制備供試品溶液6 份，按2.2項下色譜條件進行測定，記錄橙皮苷和黃芩苷的峰面積，分別計算兩待測目標成分含量。結果橙皮苷和黃芩苷的平均含量分別為3.776 mg·g-1、12.67 mg·g-1，橙皮苷的RSD為1.0%，黃芩苷的RSD為1.0%，表明該含量測定方法的重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取清肺排毒湯凍干物同一份供試品溶液(臨用新配)，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h，按2.2項下色譜條件進行測定，記錄橙皮苷和黃芩苷的峰面積，根據(jù)峰面積考察樣品溶液的穩(wěn)定性。計算得橙皮苷峰面積的RSD為1.0%，黃芩苷峰面積的RSD為0.7%，結果表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗 取同一批次已知含量的清肺排毒湯凍干物樣品(批號：2008003)適量，研細，取6 份，每份約0.25 g，精密稱定，根據(jù)清肺排毒湯凍干物樣品中橙皮苷和黃芩苷的含量按1∶1的比例添加橙皮苷和黃芩苷對照品，按2.3.2項下的方法進行制備操作，按2.2項下的色譜條件進行測定，計算兩待測成分的加樣回收率，結果見表1。結果表明本含量測定方法具有良好的回收率。

表1 清肺排毒湯凍干物加樣回收率試驗結果 (n=6)

2.10 樣品含量測定 取清肺排毒湯凍干物3批樣品適量，置碾缽中研細，取約0.5 g，精密稱定，按2.3.2項下的方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進行測定，記錄橙皮苷和黃芩苷的峰面積，分別計算兩待測目標成分含量，結果見表2。

表2 3批清肺排毒湯凍干物樣品含量測定結果

3 討論

3.1 凍干物的制備 清肺排毒湯為傳統(tǒng)湯劑，但水煎液體積大、有效成分濃度低、不易保存，且多為懸濁液，難以保證均勻取樣，不利于開展實驗。將水煎液適當?shù)蜏販p壓濃縮，再通過冷凍干燥方法，將清肺排毒湯浸膏制成質量穩(wěn)定、均一、易于溶解且無輔料添加的凍干物，且可使清肺排毒湯有效成分的分解和損失最小，從而提高后續(xù)研究的效率和質量，為清肺排毒湯成方制劑的開發(fā)提供借鑒。

3.2 檢測波長的選擇 在190～400 nm范圍對橙皮苷和黃芩苷進行紫外掃描，得到橙皮苷的最大吸收波長為283 nm，黃芩苷的最大吸收波長為277 nm。樣品中橙皮苷的含量相對低，為了提高對橙皮苷的檢測靈敏度，實驗選用283 nm作為檢測波長。在該波長下，2種黃酮類成分色譜峰形較好，檢測靈敏度均能達到測定要求。

3.3 提取條件考察 在固定超聲提取60 min的條件下，對提取溶劑進行比對，分別采用30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇作為提取溶劑，以清肺排毒湯凍干物中橙皮苷、黃芩苷的綜合提取率為指標，結果以70%甲醇作為提取溶劑對橙皮苷、黃芩苷2種成分提取效果最佳。仍以清肺排毒湯凍干物中橙皮苷、黃芩苷的綜合提取率為指標，對超聲處理和加熱回流兩種提取方式進行比對試驗，以超聲提取對2種成分的提取效果為佳。最后對15、30、45和60 min四個提取時間進行比對試驗，結果超聲45 min和60 min接近，為節(jié)省提取時間，最終選擇超聲45min。

3.4 流動相考察 實驗中比較了甲醇-磷酸和乙腈-磷酸兩種流動相系統(tǒng)，在乙腈-磷酸系統(tǒng)下橙皮苷和黃芩苷獲得了更好的峰形和分離效果，最終確定以乙腈-0.2%磷酸溶液(20:80)為流動相。

3.5 耐用性考察 實驗中考察了方法的耐用性：比較不同的色譜柱(Agilent ZORBAX SB C18、Capcell Pak C18、Thermo Scientific Syncronis C18)，結果供試品在3種色譜柱上均能得到較好的分離；考察柱溫(20 ℃、25 ℃、30 ℃)對色譜分離的影響，結果表明柱溫對本測定方法中兩種成分的分離效果有較大的影響，柱溫在30 ℃時兩種成分與其前后峰的分離效果最佳，建議將柱溫控制在30 ℃。

3.6 后續(xù)研究工作的探索 質量控制是開展中藥及復方研究工作的首要問題[13-14]。本實驗建立的同時測定清肺排毒湯凍干物中橙皮苷和黃芩苷2種黃酮類成分的含量測定方法，可為清肺排毒湯質量研究提供借鑒，為清肺排毒湯后續(xù)的成方制劑開發(fā)奠定研究基礎。清肺排毒湯藥味較多，化學成分復雜，除黃酮類成分外，還有生物堿等其他化學成分，對清肺排毒湯方中其它藥味進行質量控制的研究可進一步深入。