基于整合藥理學(xué)平臺(tái)莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)抗癌的分子作用機(jī)制

王 穎 吳 群 羅 莉 楊 柱 龍奉璽 唐東昕*

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,貴州 貴陽 550000;2.貴州省中醫(yī)腫瘤傳承與科技創(chuàng)新人才基地,貴州 貴陽 550000;3.貴航貴陽醫(yī)院,貴州 貴陽 550000

癌癥一直是世界范圍內(nèi)威脅人類生命健康的難題之一，也是世界范圍內(nèi)人類死亡的主要原因[1]。在我國，癌癥患者的死亡率較高，已成為我國居民死亡的首位因素[2-3]。中醫(yī)以其獨(dú)特的理論認(rèn)識(shí)指導(dǎo)癌癥疾病的防治已有幾千年歷史，從《黃帝內(nèi)經(jīng)》時(shí)期至今不斷豐富、發(fā)展，在減毒增效，防止復(fù)發(fā)等方面均具有明顯優(yōu)勢(shì)[4-5]。運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)方法來揭示中醫(yī)藥的科學(xué)內(nèi)涵是當(dāng)今中醫(yī)藥繼續(xù)深入發(fā)展的重要內(nèi)容之一，也是豐富和發(fā)展中醫(yī)藥理論的有效途徑。

因此，本研究基于國醫(yī)大師劉尚義教授辨證治療惡性腫瘤的數(shù)據(jù)挖掘，以莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)為例，從分子機(jī)制層面梳理和闡釋名醫(yī)經(jīng)驗(yàn)。

莪術(shù)為姜科植物莪術(shù)的干燥根莖，出自《藥性論》，其性味溫、辛、苦，有消積破血、止痛行氣的功用[6-7]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[7-9]證明，莪術(shù)揮發(fā)油具有抗癌、抗炎、保肝等作用，能通過延遲腫瘤細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)正常組織的侵襲來治療腫瘤疾病。冬凌草味甘、苦，其性寒，具有清熱、解毒、止痛、活血的功效?，F(xiàn)代研究證明。冬凌草中的活性成分具有廣泛的抗腫瘤增殖活性、可以靶向地觸發(fā)不同腫瘤細(xì)胞系中的細(xì)胞周期停滯，凋亡和自噬通路，還具有抗炎、抗菌等作用[10-12]。在臨證治療惡性腫瘤中，國醫(yī)大師劉尚義教授常在組方中辨證使用莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)治療多種惡性腫瘤[13]，如肝癌[14]、結(jié)直腸癌[15]、乳腺癌[16]等，在增強(qiáng)療效、減輕放化療副作用方面療效顯著，但其具體的分子生物機(jī)制尚不明確。

整合藥理學(xué)是一門包括中藥學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、計(jì)算科學(xué)等多學(xué)科融合的交叉學(xué)科，其主要研究方法包括大數(shù)據(jù)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、體外活性評(píng)價(jià)研究以及數(shù)據(jù)挖掘，包含如中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫、疾病靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫等多個(gè)權(quán)威數(shù)據(jù)庫和多個(gè)數(shù)據(jù)分析方法，可以克服各個(gè)中藥分析方法和內(nèi)容之間關(guān)聯(lián)性不足等問題[17]。本研究借助中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)V2.0(http://www.tcmip.cn/)，探索莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)抗癌的作用機(jī)制，為其臨床運(yùn)用提供分子生物學(xué)理論依據(jù)。

1 方法

1.1 莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)化學(xué)成分收集 在中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)V2.0 的中藥材和中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫中，分別收集莪術(shù)、冬凌草的化學(xué)成分，同時(shí)構(gòu)建莪術(shù)-冬凌草化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

1.2 莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)靶點(diǎn)收集和分析 使用中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)V2.0 的中藥靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫，利用TCMIP數(shù)據(jù)庫的二維結(jié)構(gòu)相似性搜索(MACCS分子指紋)方式，通過開源軟件進(jìn)行特征提取, 再采用Tanimoto系數(shù)定義的相似度計(jì)量方法, 篩選相似性分?jǐn)?shù)≥0.8的靶點(diǎn)作為候選靶點(diǎn)[18-20]。

1.3 疾病靶標(biāo)收集 在中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)V2.0的疾病相關(guān)分子庫中，使用“cancer”作為關(guān)鍵字進(jìn)行檢索，將檢索出的所有靶標(biāo)作為疾病的候選靶標(biāo)。

1.4 蛋白間相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將莪術(shù)靶標(biāo)、冬凌草靶標(biāo)、癌癥靶標(biāo)分別導(dǎo)入Venny 2.1在線工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖。再將莪術(shù)、冬凌草、癌癥的靶標(biāo)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)中，選擇物種為“Homo sapiens ”，將滿足條件(degree大于中位數(shù))的靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件，繪制莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)靶標(biāo)-疾病靶標(biāo)相互作用的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 核心靶標(biāo)基因生物過程分析 使用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)在線工具對(duì)核心靶標(biāo)進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路富集分析。

1.6 構(gòu)建“藥對(duì)-活性成分-核心靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò) 使用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-核心靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”的可視化多層次相關(guān)聯(lián)的整合網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 藥對(duì)核心成分藥代動(dòng)力學(xué)分析 在中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)V2.0的中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫中，以藥物核心化學(xué)成分作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取其吸收、分布、清除、毒性的藥物性質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)化學(xué)成分及靶標(biāo)預(yù)測(cè)分析 根據(jù)篩選條件，共在中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)V2.0中獲得莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)化學(xué)成分174個(gè)，共有預(yù)測(cè)靶標(biāo)843個(gè)。其中，莪術(shù)化學(xué)成分有141個(gè)，預(yù)測(cè)靶標(biāo)有442個(gè)；冬凌草化學(xué)成分有35個(gè)，預(yù)測(cè)靶標(biāo)有401個(gè)。合并去重后，共得到靶標(biāo)246個(gè)。對(duì)篩選出的藥對(duì)靶標(biāo)通過DAVID 6.8在線工具進(jìn)行生物信息分析，分別取P值最小的10個(gè)功能富集進(jìn)行分析(如圖1所示)。GO功能富集顯示，候選靶標(biāo)的生物過程主要有離子轉(zhuǎn)運(yùn)、對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的應(yīng)答、無機(jī)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等。KEGG通路富集顯示，候選靶標(biāo)的信號(hào)通路主要有尼古丁成癮、cAMP信號(hào)通路、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。

2.2 莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)治療癌癥的核心靶標(biāo)分析 在中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)V2.0的疾病相關(guān)分子庫中檢索到的癌癥的靶標(biāo)共有390個(gè)，韋恩圖分析結(jié)果顯示，莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)與癌癥共有19個(gè)交集的靶標(biāo)，其中，屬于莪術(shù)的有13個(gè)靶標(biāo)，屬于冬凌草的有17個(gè)靶標(biāo)，二者共同靶標(biāo)有11個(gè)。通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)V2.0數(shù)據(jù)庫，基于STRING 11.0數(shù)據(jù)庫中PPI相互作用，構(gòu)建莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)與癌癥靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)篩選條件，共篩選出核心靶標(biāo)191個(gè)，選取Degree值前100的靶標(biāo)來構(gòu)建核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖(如圖2所示)。其中，莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)直接作用靶標(biāo)23個(gè)，癌癥靶標(biāo)71個(gè)，藥對(duì)和疾病共有靶標(biāo)6個(gè)。共有靶標(biāo)分別為原癌基因c-Abl、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、鈣調(diào)蛋白1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6、核因子NF-kappa-B p105亞基和前列腺素G / H合酶2。

注：由內(nèi)到外依次為共有靶標(biāo)、藥對(duì)靶標(biāo)、疾病靶標(biāo)圖2 莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)治療癌癥核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 核心靶標(biāo)基因生物過程分析

2.3.1 莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因GO生物功能分析 使用DAVID 6.8在線工具對(duì)核心靶標(biāo)中Degree值排在前100的靶標(biāo)進(jìn)行GO功能分析，共得到326個(gè)生物功能信息，取P值最小的前10位進(jìn)行分析(表1，圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核心靶標(biāo)主要富集于細(xì)胞對(duì)有機(jī)物的應(yīng)答、大分子代謝過程的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)內(nèi)源性刺激的應(yīng)答等與細(xì)胞代謝、調(diào)控、傳導(dǎo)等相關(guān)的生物過程。

圖3 莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)治療癌癥核心靶標(biāo)GO生物學(xué)功能氣泡圖

表1 莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)治療癌癥核心靶標(biāo)GO生物學(xué)功能信息

2.3.2 莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因KEGG通路富集分析 使用DAVID 6.8在線工具對(duì)核心靶標(biāo)中Degree值排在前100的靶標(biāo)進(jìn)KEGG通路富集分析，取P值最小的前10位進(jìn)行分析(表2，圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核心靶標(biāo)主要富集于癌癥通路，IL-17信號(hào)通路，TNF信號(hào)通路等。

表2 莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)治療癌癥KEGG通路信息

圖4 莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)治療癌癥核心靶標(biāo)KEGG通路氣泡圖

2.4 “藥對(duì)-活性成分-核心靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”多維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 以2.3.2項(xiàng)中所富集分析出的P值最小的前十位KEGG通路來構(gòu)建“藥對(duì)-活性成分-核心靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”多維網(wǎng)絡(luò)(圖5)。結(jié)果顯示，該多維網(wǎng)絡(luò)圖涉及了莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)中39個(gè)成分和25個(gè)靶標(biāo)。其中包括莪術(shù)成分20個(gè)，冬凌草成分19個(gè)。這些成分通過對(duì)半胱氨酸蛋白酶3、雌激素受體1、白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子原癌基因c-Abl、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、鈣調(diào)蛋白1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6、核因子NF-kappa-B p105亞基和前列腺素G / H合酶2等25個(gè)靶標(biāo)的聯(lián)合調(diào)控，參與了癌癥通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、乙肝、雌激素信號(hào)通路、非酒精性脂肪肝等信號(hào)通路。其中原癌基因c-Abl、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、鈣調(diào)蛋白1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6、核因子NF-kappa-B p105亞基和前列腺素G / H合酶2為莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)與癌癥共有靶標(biāo)。

經(jīng)過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)V2.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析顯示，冬凌草中棕櫚酸通過與原癌基因c-Abl和鈣調(diào)蛋白1作用參與了癌癥通路；莪術(shù)中油松蛋白通過與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1作用參與了癌癥通路、雌激素受體通路、非酒精性脂肪肝、乙肝和TNF信號(hào)通路；莪術(shù)中油松蛋與冬凌草中毒馬草黃酮共同與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6作用，參與了癌癥途徑；冬凌草中熊果酸、Guidongnin、冬凌草甲素、Rabdoternin C、冬凌草甲素C、冬凌草甲素H通過與核因子NF-kappa-B p105亞基作用參與了癌癥通路、雌激素受體通路、IL-17信號(hào)通路、乙肝、非酒精性脂肪肝、TNF信號(hào)通路；冬凌草中棕櫚酸通過與前列腺素G / H合酶2作用，參與癌癥途徑、IL-17信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路。推測(cè)莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)通過這些化學(xué)成分作用于原癌基因c-Abl、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、鈣調(diào)蛋白1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6、核因子NF-kappa-B p105亞基和前列腺素G / H合酶2從而參與了癌癥通路、雌激素受體通路、IL-17 信號(hào)通路、乙肝、非酒精性脂肪肝、TNF信號(hào)通路，進(jìn)而達(dá)到抗癌的作用。

2.5 莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)核心成分藥代動(dòng)力學(xué)分析 根據(jù)2.4中多維網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，在中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái) V2.0中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫中，對(duì)作用于共有靶標(biāo)的化學(xué)成分進(jìn)行ADMET水平分析(表3)。根據(jù)ADMET 描述符[21]，吸收、代謝水平從0～3分別表示“良好”、“中等”、“弱”、“很弱”，血腦屏障分布水平從0～4分別表示“很高”、“高”、“中等”、“未闡明”，血漿蛋白結(jié)合率水平從0～2分別表示結(jié)合率<90%、結(jié)合率>90%、結(jié)合率>95%，肝毒性以0和1分別表示“無毒”“有毒”，而化學(xué)成分類藥性級(jí)別則根據(jù)中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)V2.0數(shù)據(jù)庫算出的類藥性比重來劃分，>0.67為“良好”、0.46～0.67為“中等”、<0.67為“弱”。

注：從上到下依次為為中藥藥對(duì)、藥物成分、核心靶點(diǎn)、紅色矩形為關(guān)鍵通路圖5 莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)治療癌癥的“藥對(duì)-活性成分-核心靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”多維網(wǎng)絡(luò)圖

表3 莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)核心成分藥代動(dòng)力學(xué)分析

分析結(jié)果顯示，莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)核心成分的吸收水平和代謝水平良好，藥物肝毒性主要是劑量依賴性的肝損傷，核心成分可以穿透血腦屏障，同時(shí)與血漿蛋白結(jié)合率較高，可以在抗癌治療中有效發(fā)揮作用。

3 討論

癌癥是一種全身性的疾病，任何單一治療都不能取得徹底、良好的療效。中西醫(yī)聯(lián)合治療癌癥，可以充分發(fā)揮各自優(yōu)勢(shì)，達(dá)到治療目的[4]。

本研究基于國醫(yī)大師劉尚義教授的臨床經(jīng)驗(yàn)，以其常用的莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)為例，借助中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)V2.0，探索莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)抗癌的作用機(jī)制。通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái) V2.0數(shù)據(jù)庫共獲取莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)174個(gè)化學(xué)成分，合并去重后，得到預(yù)測(cè)靶標(biāo)共246個(gè)，同時(shí)基于STRING數(shù)據(jù)庫所構(gòu)建的藥對(duì)靶標(biāo)和疾病靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選出核心靶標(biāo)，其中藥對(duì)與疾病共有的靶標(biāo)分別為原癌基因c-Abl、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、鈣調(diào)蛋白1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6、核因子NF-kappa-B p105亞基和前列腺素G / H合酶2，推測(cè)這些靶標(biāo)可能是莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)抗癌的重要靶標(biāo)。經(jīng)過GO生物功能和KEGG通路分析，這些藥物靶標(biāo)主要參與細(xì)胞內(nèi)代謝、調(diào)控、傳導(dǎo)等相關(guān)信號(hào)傳遞的生物過程，核心靶標(biāo)富集于多條與癌癥相關(guān)的信號(hào)通路，如癌癥通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等。大約有20%的癌癥都與慢性炎癥有關(guān)，大多數(shù)實(shí)體腫瘤的炎癥浸潤都有促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)[22]。白細(xì)胞介素17作為驅(qū)動(dòng)自身免疫和炎性疾病的細(xì)胞因子，在癌癥進(jìn)展、宿主防御、炎癥性疾病的發(fā)病等對(duì)多種過程中都有著非常重要的作用，同時(shí)其家族中的細(xì)胞因子也在炎癥誘導(dǎo)中起著核心作用[23-24]。研究證明[25-27]，IL-17信號(hào)傳導(dǎo)在多種癌癥的發(fā)生中都起到了重要作用，它可以介導(dǎo)炎癥發(fā)生，增強(qiáng)致癌基因的突變而促使癌癥的發(fā)生，并在腫瘤內(nèi)放大IL-17反應(yīng)，從而促進(jìn)組織再生，促進(jìn)腫瘤生長和發(fā)展。作為主要的促炎癥細(xì)胞因子，腫瘤壞死因子參與了癌變的各個(gè)方面，在多種癌癥中充當(dāng)了內(nèi)源性腫瘤啟動(dòng)子[28-30]，在腫瘤中腫瘤壞死因子的生理濃度對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用，同時(shí)，腫瘤壞死因子可以通過誘導(dǎo)或上調(diào)下游趨化因子促進(jìn)體內(nèi)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移以及血管生成[31-33]。雌激素是一種多效類固醇，在眾多的生理過程中都起到了調(diào)節(jié)的作用，除了介導(dǎo)與體內(nèi)穩(wěn)態(tài)有關(guān)的生物學(xué)機(jī)制外，還參與多種激素敏感性癌癥如乳腺癌、前列腺癌等的生物過程，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的存活、增殖等[34-35]。

在預(yù)測(cè)出的莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)活性成分中，直接作用于原癌基因c-Abl、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1等6個(gè)重要靶標(biāo)的成分中，冬凌草中棕櫚酸可以通過ER應(yīng)激促使細(xì)胞凋亡和自噬[36]。莪術(shù)中油松蛋白可作用于多種癌細(xì)胞，并通過調(diào)控相應(yīng)靶標(biāo)來抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移，同時(shí)促使其凋亡[37-38]。另外，冬凌草中熊果酸、冬凌草甲素等均具有廣泛的抗炎、抗癌作用，在抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡的同時(shí)，還可降低化療藥耐藥性[39-42]。

本研究通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)V2.0預(yù)測(cè)分析莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)抗癌的核心靶標(biāo)，并對(duì)核心靶標(biāo)所參與的生物過程進(jìn)行分析，在構(gòu)建出的“藥對(duì)-活性成分-核心靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”多維網(wǎng)絡(luò)圖中，闡明莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)抗癌的分子作用機(jī)制，其預(yù)測(cè)出的癌癥通路、TNF信號(hào)通路等相關(guān)通路均與文獻(xiàn)報(bào)道的癌癥發(fā)病機(jī)制相符，證明整合藥理學(xué)研究技術(shù)的全面性和可靠性。

本研究基于整合藥理學(xué)技術(shù)，從多個(gè)角度梳理了莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)抗癌的潛在分子作用機(jī)制，結(jié)果顯示，莪術(shù)-冬凌草藥對(duì)是通過多靶點(diǎn)、多途徑來發(fā)揮的抗癌作用，為臨床運(yùn)用提供依據(jù)，也為其后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供參考。