牛耳楓質(zhì)量標準提升研究

唐靖雯 彭政忠 潘 梅 李嬌嬌 楊 桃 潘 婷 王 歡

貴州威門藥業(yè)股份有限公司，貴州 貴陽 550018

牛耳楓為虎皮楠科交讓木屬植物牛耳楓DaphniphyllumcalycinumBenth的干燥帶葉莖枝，收載于《廣西中藥材標準》，具有清熱解毒、活血舒筋的功效，分布于湖南、廣東、江西等地[1-2]。主要含有黃酮類化合物及少量的生物堿、三萜類、甾醇類和酚酸類等其它化合物，其中黃酮類化合物蘆丁不僅具有調(diào)節(jié)毛細血管壁的滲透性和脆性、防止血管破裂、止血的作用，還具有抗菌消炎、抗氧化等作用[3-4]。牛耳楓可治療糖尿病、心血管疾病和高血壓等多種疾病，其葉和種子中含有的生物堿具有抗腫瘤的作用[5]，種子可榨油做肥皂、潤滑油等[6]。牛耳楓作為臨床上常用中藥，其質(zhì)量真?zhèn)?、?yōu)劣嚴重影響臨床療效，但目前只有《廣西中藥材標準》[7]的質(zhì)量標準中僅有性狀、顯微鑒別，缺少具有代表性的薄層鑒別和含量測定，不夠全面反映牛耳楓藥材的內(nèi)在質(zhì)量，達不到判斷質(zhì)量優(yōu)劣的目的。因此本研究在牛耳楓的性狀、顯微鑒別的基礎上增加薄層鑒別、含量測定，并考察了水分、總灰分和浸出物，以更有效地鑒定牛耳楓藥材質(zhì)量，為牛耳楓藥材的進一步開發(fā)應用提供鑒定依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀Agilent-1260型(美國Agilent公司)；檢測器：二極管陣列檢測器；萬分之一電子天平AY120型(日本島津公司)；十萬分之一電子天平AG135型(瑞士梅特勒公司)。

1.2 藥品與試劑 乙腈(色譜純，美國TEDIA天地試劑公司)；娃哈哈純凈水；水合氯醛、間苯三酚、濃鹽酸、稀甘油均為分析純；牛耳楓對照藥材(批號：121660-201201)，中國食品藥品檢定研究院；蘆丁對照品(批號：100080-201409；含量：91.9%)，中國食品藥品檢定研究院。

研究所用的牛耳楓藥材均來源于廣西、湖南和廣東等地，詳見表1。

表1 樣品來源表

2 方法與結(jié)果

2.1 形態(tài)鑒別 主干呈類圓柱形，直徑0.8～4.0 cm，切后呈斜切片，切片橢圓形，直徑1.0～5.0 cm，厚0.3～1.0 cm，皮表面具皮孔，灰褐色至褐色，質(zhì)堅硬，不易折斷；枝呈圓柱形，直徑0.3～2.0 cm，切后呈斜切片狀或枝段，切片橢圓形，直徑0.3～3.0 cm，厚0.2～0.8 cm，枝段直徑0.3～0.5 cm，長0.5～1.5 cm，表面灰綠色或淺灰棕色，具稀疏皮孔，體輕質(zhì)硬，較難折斷，斷面灰白色或淺棕色，髓部疏松或形成髓腔。葉片基部寬楔形，全緣；上表面草綠色至淺灰棕色，下表面淺綠色至灰棕色；葉脈下表面突起，側(cè)脈明顯；葉柄長3～8 cm，革質(zhì)。偶見果實，果實卵圓形，具有不規(guī)則的皺紋。氣微，味苦澀。如圖1所示。

圖1 牛耳楓形態(tài)鑒定(來源于廣西省桂林市荔浦縣)

2.2 顯微鑒定 莖橫切面：表皮具表皮細胞1列，外被厚角質(zhì)層；有的老枝可見木栓層。皮層由數(shù)列至十余列薄壁細胞組成，內(nèi)含眾多草酸鈣簇晶，有的薄壁細胞含黃褐色塊狀物。韌皮部由1～2列細胞組成韌皮射線，細胞內(nèi)常見草酸鈣簇晶。木質(zhì)部寬廣，導管類方形或多角形，多單個或 2～3個成群，木纖維胞腔較大，木射線為1～2列細胞組成。髓部薄壁細胞類圓形；中央多成空隙。葉表面觀：上表皮細胞垂周壁波狀彎曲，部分細胞含草酸鈣簇晶，常并列或成群分布。下表皮細胞垂周壁較平直，乳頭狀突起呈小圓圈狀，氣孔平軸式；草酸鈣簇晶較多，常并列或成群分布。粉末：粉末灰褐色或黃灰色。內(nèi)含草酸鈣簇晶較多，直徑10～30 μm，大多存在于細胞內(nèi)。石細胞類圓形或類長多角形，胞腔內(nèi)含紅棕色內(nèi)含物。導管多為螺紋導管和梯紋導管，直徑23～45 μm。纖維束狹長，長短不一。粉末中偶有破碎的細胞塊，如葉下表皮細胞垂周壁較平直，乳頭狀突起呈小圓圈狀，氣孔平軸式。如圖2所示。

圖2 牛耳楓顯微鑒定

2.3 薄層鑒別 取牛耳楓粉末1 g，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇 1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取牛耳楓對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液；再取蘆丁對照品，加甲醇制成每1 mL含1.0 mg的溶液，作為對照品溶液。按2015年版《中國藥典》四部通則0502薄層色譜法試驗，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈365 nm下檢視，結(jié)果如圖3所示。在供試品、對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

圖3 牛耳楓TLC色譜圖

2.4 檢查項及浸出物 采用2015年版《中國藥典》四部通則0832水分測定法第二法(烘干法)測定含水量，通則2302灰分測定法測定總灰分，通則2201項下醇溶性浸出物測定法(熱浸法)測定浸出物含量(溶劑：稀乙醇)，平行3份，結(jié)果見表2。根據(jù)測定的結(jié)果，初步擬定含水量不超過11.0%，總灰分含有量不得超過5.0%，浸出物含有量不得少于14.0%。

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液(54∶46，V/V)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：354 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；理論板數(shù)按蘆丁峰計算應不低于3000。

2.5.2 溶液制備 對照品溶液的制備：取蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。供試品溶液的制備：取本品粉末(過二號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3 系統(tǒng)適用性試驗 分別精密吸取“2.5.2”項下蘆丁對照品溶液、供試品溶液及缺牛耳楓藥材的陰性空白溶液按“2.5.1”項下色譜條件進行測定，分離度R=1.8，理論塔板數(shù)為5500。色譜如圖4所示。

表2 水分、總灰分、浸出物含有量測定結(jié)果 (n=3)

圖4 蘆丁HPLC色譜圖

2.5.4 線性關系 精密吸取蘆丁對照品貯備液(200.34 μg/mL) 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分別置10 mL的量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，分別進樣10 μL，按“2.5.1”項下色譜條件，各進樣10 μL， 記錄峰面積。以對照品的質(zhì)量數(shù)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸。回歸方程：A=1696.9C-21.296，r=0.9996。結(jié)果表明，蘆丁在0.200～1.403 μg范圍內(nèi)，其質(zhì)量數(shù)與峰面積呈良好的線性關系。

2.5.5 精密度試驗 精密吸取蘆丁對照品溶液(80.2 μg/mL) 10 μL，重復進樣6次，按“2.5.1”項下色譜條件測定其峰面積。結(jié)果RSD為1.17%，表明儀器精密度較好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗 取牛耳楓藥材按“2.5.2”項下法制成供試品溶液，“2.5.1”項下色譜條件分別于0、3、6、9、15、24 h測定其峰面積。結(jié)果，蘆丁峰面積的RSD為0.41%，說明牛耳楓藥材供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 重復性試驗 分別精密稱取牛耳楓藥材粉末(藥材編號：Y063-15-11-24-01)6份，按 “2.5.2”項下法制成供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進行測定，以外表一點法計算蘆丁含量。結(jié)果，蘆丁含量的RSD為1.47%，表明該方法的重復性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗 分別精密稱取9份已知含量的牛耳楓藥材粉末(過二號篩) (藥材編號：Y063-15-11-24-01) 1 g，置于具塞錐形瓶中，按蘆丁對照品與牛耳楓藥材中蘆丁含量1.5∶1、1∶1、0.5∶1加入蘆丁對照品，按“2.5.2”項下法制成供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進行測定。結(jié)果：牛耳楓藥材中蘆丁平均回收率為101.65%，RSD為2.42%，說明該方法可用于測定牛耳楓藥材中蘆丁的含量，結(jié)果詳見表3。

表3 蘆丁加樣回收率試驗結(jié)果

2.5.9 樣品含量測定 取20批不同產(chǎn)地牛耳楓藥材，按“2.5.2”項下法制成供試品溶液和按“2.5.1”項下色譜條件進行測定其峰面積。以干燥品計算牛耳楓藥材中蘆丁的含量(%)。結(jié)果詳見表4。根據(jù)測定的結(jié)果，初步擬定蘆丁含量不得低于0.07%。

表4 不同產(chǎn)地牛耳楓藥材蘆丁含量測定

3 討論

3.1 指標性成分的確定 牛耳楓主要成分為黃酮類、酚酸類和生物堿類。據(jù)文獻報道[8]，從牛耳楓枝干和葉中分離可得到羽扇豆酮、β-谷甾醇、胡蘿卜苷、deoxycalyciphylline B、daphiodhanins D、calyciphylline B、槲皮素、蘆丁等化合物，其蘆丁是牛耳楓中主要的黃酮類成分；因此，本研究以蘆丁作為指標進行含量測定。

3.2 展開劑的考察 本研究以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G板為載體，5%三氯化鋁乙醇溶液為顯色劑，曾采用乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液(20∶5∶1)[9]、甲苯(水飽和)-甲酸乙酯-甲酸(4∶4∶2)[10]作為展開劑進行研究，但因斑點不清晰，且存在拖尾現(xiàn)象；因此，研究中調(diào)整了展開劑及比例，分別以丙酮-乙酸-水(9∶1∶1)、丙酮-甲酸-水(10∶1∶1)、乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)為展開劑進行考察研究，結(jié)果表明：以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)為展開劑，斑點清晰，分離度好。

3.3 TLC法耐用性考察 本研究考察了溫度(25 ℃、4 ℃)、相對濕度(75%、52%) 、廠家、薄層硅膠板(G型、H型)對蘆丁TLC鑒別的影響，發(fā)現(xiàn)各廠家G 型硅膠板在不同溫度、相對濕度下，TLC 色譜圖中蘆丁斑點清晰，與相鄰斑點分離度較好，而H 型硅膠板效果較差，故選擇G 型板。

3.4 HPLC法耐用性考察 本研究考察了色譜柱[Ultimate XB-C18(250×4.6 mm)、Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)、Agilent TC-C18(2) (250×4.6 mm，5 μm)]，柱溫(25 ℃、30 ℃、40 ℃)，流動相比例[乙腈-0.1%磷酸(16∶84)、乙腈-0.1%磷酸(15∶85)、乙腈-0.11%磷酸(14∶86)]，流速(0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min)，考察發(fā)現(xiàn)流動相比例和流速的改變對蘆丁的檢測影響較大。

4 結(jié)論

本研究通過對牛耳楓水分、灰分、浸出物的測定，為制訂牛耳楓藥材質(zhì)量標準提供實驗依據(jù)；對牛耳楓顯微鑒別、薄層鑒別、含量測定進行較為全面的研究，建立專屬性強的定性、定量測定方法，能夠準確、科學地評價牛耳楓質(zhì)量，也為相關地方標準的制定以及現(xiàn)有質(zhì)量標準的提升提供參考。