乳腺癌組織中miR-502和HDAC3表達(dá)的相關(guān)性及其臨床意義

趙云飛， 何 姣， 楊 玲， 劉 智， 羅啟翅， 陳茂山

(遂寧市中心醫(yī)院 1.病理科，2.乳腺甲狀腺外科，四川省遂寧市 629000)

乳腺癌是臨床上較為常見的女性惡性腫瘤，發(fā)病率及致死率呈逐年增加趨勢，嚴(yán)重危及患者的生命安全[1-2]。隨著基因組學(xué)、生物信息學(xué)及分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，乳腺癌標(biāo)志物篩選及其靶點治療已成為關(guān)注的焦點[3]。微小RNA(microRNA,miRNA)屬于非編碼小分子RNA，已有多項研究表明多種miRNA參與了癌癥、免疫、代謝等疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。研究發(fā)現(xiàn)miR-502在乳腺癌[5]、宮頸癌[6]等婦科腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到不同程度的調(diào)節(jié)作用，可作為婦科腫瘤的抑癌基因。組蛋白修飾是導(dǎo)致表觀遺傳學(xué)變化的重要機(jī)制，組蛋白去乙?；?(histone deacetylase3,HDAC3)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[7]。有研究表明HDAC3在浸潤性乳腺癌中異常高表達(dá)，起到一定的促癌基因作用[8]。本文探討miR-502和HDAC3在乳腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，及對乳腺癌診斷效能和預(yù)后的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇本院2015年5月—2017年12月76例經(jīng)手術(shù)病理證實的乳腺癌患者，收集其癌旁組織及癌組織標(biāo)本。患者年齡36～73歲，平均(55.12±7.20)歲。全部患者均簽署知情協(xié)議書，并獲本院倫理委員會批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)病理學(xué)診斷為乳腺癌，并符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；首次確診；臨床資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受放化療及免疫治療；依從性低或精神障礙者；合并其他惡性腫瘤；嚴(yán)重內(nèi)科疾??；患嚴(yán)重感染、造血功能障礙及免疫缺陷疾病。

1.2 儀器與材料

RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司；PrimeScript RT試劑盒及SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自默沙克生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；miR-502、HDAC3、U6、磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物購自Takara公司；紫外分光光度計及蛋白提取試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；BSA試劑盒購自北京中生利康科技有限公司；HDAC3、GAPDH相關(guān)抗體、BCA試劑盒、熒光素酶試劑盒均購自Abcam公司；蘇木精購自上海博谷生物科技有限公司；圖像掃描系統(tǒng)購自上海涵飛醫(yī)療器械有限公司。

1.3 熒光定量PCR檢測

提取各組織中總RNA。其中miR-502以U6為內(nèi)參，HDAC3以GAPDH為內(nèi)參。定量RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系10 μL，反應(yīng)條件：37 ℃、15 min×3次、85 ℃ 5 s。實施熒光定量PCR操作，反應(yīng)體系50 μL：SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(2×)25 μL，PCR上游和下游引物均2 μL，ROX Reference Dye(50×) l μL，ddH2O 16 μL，DNA模板4 μL。miR-502反應(yīng)條件：94 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；72 ℃ 1 min，40個循環(huán)；HDAC3反應(yīng)條件：95 ℃ 15 s；95 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s；72 ℃ 10 s，40個循環(huán)。通過2-ΔΔCt法計算目的基因(miR-502、HDAC3)的相對轉(zhuǎn)錄水平。引物序列：miR-502正向引物：5′-ATCCTTGCTATCTGGGTGCTA-3′，反向引物：5′-CGAGCTCGGATCCACTAGTCC-3′；HDAC3正向引物：5′-CCTGGCATTGACTCATAG-3′，反向引物：5′-ATTAAGGCTCTTGGTGAAA-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH正向引物：5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3′，反向引物：5′-GACGCCAGTAGACTCCACGACA-3′。

1.4 免疫組化

組織標(biāo)本固定于10%的甲醛中，常規(guī)石蠟包埋切片(厚4 μm)，置于60 ℃溫箱1 h，常規(guī)脫蠟脫水，3%雙氧水中37 ℃孵育0.5 h，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗，放于0.01 mol/L檸檬酸綜合證緩沖液中，95 ℃ 20 min，冷卻至室溫，PBS沖洗。羊血清工作液封閉，37 ℃ 10 min。放入一抗：HDAC3(1∶250)，4 ℃過夜，PBS沖洗。滴加相應(yīng)的二抗室溫孵育0.5 h，顯色，蘇木精復(fù)染，封片。每張切片隨機(jī)選5個高倍視野(400×)，計算陽性細(xì)胞所占百分比，陽性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)[9]：細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒。

1.5 免疫印跡檢測

提取組織標(biāo)本中蛋白，按照BCA試劑盒說明書定量，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)，將PAGE膠中蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶，室溫密封1 h，加一抗：HDAC3(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，沖洗后，將相應(yīng)二抗與PVDF膜至室溫孵育1 h。漂洗、化學(xué)發(fā)光、暗室曝光，顯影并定影，通過圖像掃描系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.6 熒光素酶報告實驗

通過生物信息學(xué)http://www.targetscan.org/vert_72/、https://cm.jefferson.edu/網(wǎng)站預(yù)測miR-502和HDAC3的靶向關(guān)系，了解miR-502與HDAC3 3′UTR的結(jié)合位點。PCR反應(yīng)擴(kuò)增HDAC3結(jié)合位點片段，循環(huán)后72 ℃繼續(xù)延伸3 min，4 ℃保存。經(jīng)瓊脂糖電泳分析，PCR產(chǎn)物純化，經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)大菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，構(gòu)建HDAC3 3′UTR野生型(WT)質(zhì)粒(HDAC3-WT)。并以質(zhì)粒為基礎(chǔ)，構(gòu)建HDAC3 3′UTR突變型(MUT)質(zhì)粒(HDAC3-MUT)。將對數(shù)生長的293T細(xì)胞于96孔板中接種，待對數(shù)生長期時，將HDAC3-MUT和HDAC3-WT的載體分別和mimic-NC或miR-502 mimic共轉(zhuǎn)至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后收集并裂解細(xì)胞，離心取上清，熒光素酶試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.7 臨床病理特征分析

分析患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體/孕激素受體(ER/PR)表達(dá)情況。根據(jù)癌組織miR-502、HDAC3相對表達(dá)中位數(shù)將乳腺癌患者分為高、低表達(dá)組，分析miR-502、HDAC3不同表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床病理資料之間的關(guān)系及對乳腺癌患者的診斷效能和預(yù)后生存的影響?；颊唠S訪時間至2020年12月。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 miR-502、HDAC3的溶解曲線結(jié)果

miR-502、HDAC3的產(chǎn)物溶解峰，擴(kuò)增產(chǎn)物分別在84.85、84.23 ℃出現(xiàn)單一峰，即qRT-PCR法可以檢測組織中miR-502、HDAC3的表達(dá)且具有較高的特異度(圖1)。

圖1 miR-502與HDAC3的溶解曲線

2.2 組織標(biāo)本中miR-502及HDAC3的表達(dá)情況

qRT-PCR及West blot實驗結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miR-502表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，而HDAC3基因、陽性表達(dá)率及其蛋白表達(dá)水平均顯著高于癌旁組織(P<0.05；圖2A～C)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-502與HDAC3在乳腺癌組織中呈負(fù)相關(guān)(P<0.05；圖2D)。網(wǎng)站預(yù)測HDAC3是miR-502的靶基因(圖2E、F)；熒光素酶報告實驗顯示，mimic-NC和miR-502 mimics共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后的HDAC3-WT熒光素酶活性差異有顯著性(P<0.05；圖2F)。

圖2 miR-502與HDAC3之間表達(dá)關(guān)系

2.3 miR-502、HDAC3表達(dá)與乳腺癌臨床病理資料之間的關(guān)系

根據(jù)miR-502、HDAC3相對表達(dá)水平的中位數(shù)將乳腺癌患者分為低表達(dá)組與高表達(dá)組，結(jié)果顯示，miR-502、HDAC3相對表達(dá)水平與TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER/PR表達(dá)情況有關(guān)(P<0.05；表1)。

表1 miR-502、HDAC3基因表達(dá)與乳腺癌臨床的關(guān)系 單位：例(%)

2.4 miR-502、HDAC3基因表達(dá)對乳腺癌患者的診斷效能

乳腺癌組織中miR-502、HDAC3及二者聯(lián)合表達(dá)診斷乳腺癌患者均具有一定的診斷價值，其中二者聯(lián)合診斷價值最高(表2)。

表2 miR-502、HDAC3基因表達(dá)對乳腺癌患者診斷效能的影響

2.5 miR-502、HDAC3基因表達(dá)對乳腺癌患者預(yù)后生存率的影響

miR-502高表達(dá)組患者的3年總生存率高于低表達(dá)組(P<0.05)；HDAC3高表達(dá)組患者的3年總生存率顯著低于低表達(dá)組(P<0.05；表3)。

表3 miR-502、HDAC3基因表達(dá)對乳腺癌患者預(yù)后的影響 單位：例(%)

3 討 論

現(xiàn)階段多數(shù)乳腺癌患者在確診時已處于癌癥中晚期，經(jīng)手術(shù)治療后預(yù)后并不理想，因此探尋診斷價值高、可較好反應(yīng)預(yù)后的生物靶點，對乳腺癌篩查、診治及預(yù)后改善具有重要影響，也是現(xiàn)階段臨床婦科分子生物研究關(guān)注的重點[10]。microRNA異常表達(dá)參與了惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，起到抑癌或促癌的作用[11]。

Liu等[12]發(fā)現(xiàn)miR-502處理或下調(diào)Set8可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期，減少細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，臨床分析顯示，miR-502在乳腺癌腫瘤組織中的表達(dá)低于癌旁組織。HDAC3屬于Ⅰ類組蛋白去乙酰化酶，而類組蛋白去乙酰化酶可催化生理過程中的關(guān)鍵蛋白。已有研究證實HDAC3在乳腺癌組織中表達(dá)水平高于正常組織，并與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[8]。本研究通過網(wǎng)站預(yù)測了miR-502、HDAC3之間存在一定的靶向關(guān)系，但需實驗驗證。

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miR-502表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，而HDAC3表達(dá)趨勢與之相反。這與Liu等[12]及林俊杰等[8]報道一致。說明乳腺癌組織中miR-502表達(dá)水平下調(diào)，HDAC3表達(dá)上調(diào)，分析原因：①在多種惡性腫瘤組織中，miR-502起到抑癌基因的作用，而HDAC3起到促癌基因的作用，因此在乳腺癌組織中，促癌基因發(fā)揮主要調(diào)控作用，抑癌基因表達(dá)受到抑制；②HDAC3表達(dá)上調(diào)可能受到乳腺癌組織中miR-502的靶向負(fù)調(diào)控的影響。結(jié)果顯示，二者呈負(fù)相關(guān)，且HDAC3是miR-502的直接靶基因，由此推測miR-502通過靶向負(fù)調(diào)控HDAC3參與乳腺癌病情的發(fā)生發(fā)展。

本文結(jié)果顯示miR-502、HDAC3表達(dá)水平與TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER/PR表達(dá)情況有關(guān)。TNM分期是乳腺腫瘤大小及其是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的重要體現(xiàn)，而TNM分期Ⅲ～Ⅳ期腫瘤組織中miR-502低表達(dá)及HDAC3高表達(dá)比較多，說明miR-502可能通過靶向負(fù)調(diào)控HDAC3抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移。當(dāng)ER或PR呈陰性表達(dá)時，說明激素已經(jīng)不能起到治療乳腺癌的作用，反應(yīng)乳腺癌的惡化程度較顯著[13-14]。這說明隨著乳腺癌病理分級及病情的惡化，miR-502呈下調(diào)趨勢，HDAC3呈上調(diào)趨勢，其中HDAC3病理分析結(jié)果與Zhao等[15]研究類似。

本文結(jié)果顯示，miR-502、HDAC3及二者聯(lián)合針對乳腺癌患者具有較好的診斷價值，miR-502高表達(dá)組患者的3年總生存率高于miR-502低表達(dá)組；HDAC3表達(dá)趨勢與之相反。結(jié)果說明患者癌組織中若miR-502呈低表達(dá)及HDAC3呈高表達(dá)，可一定程度反應(yīng)患者預(yù)后不良，進(jìn)一步提示miR-502及HDAC3可能成為乳腺癌治療的靶標(biāo)因子。

綜上，miR-502在乳腺癌組織中呈低表達(dá)水平，HDAC3呈高表達(dá)水平，HDAC3是miR-502的直接靶基因，二者之間呈負(fù)相關(guān)，且與患者病情發(fā)展及預(yù)后相關(guān)，可作為早期診斷乳腺癌的生物學(xué)指標(biāo)。