瘦素對綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖/凋亡的影響

賈凱琪，郭翔宇，黨文慶，李雅婷，馬曉燕，王 鍇，呂麗華

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

原始卵泡庫的大小決定了雌性哺乳動物的生殖能力，卵泡發(fā)育在雌性生殖中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪因子在卵巢生理活動中發(fā)揮著重要作用，尤其是瘦素，由肥胖基因編碼[1]。研究發(fā)現(xiàn)，瘦素缺陷小鼠的卵泡受損，卵泡顆粒細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，繁殖異常[2]。顆粒細(xì)胞（GCs）在卵泡形成和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，通過間隙連接為卵母細(xì)胞提供營養(yǎng)[3]，其增殖和凋亡影響著卵巢功能的維持和發(fā)揮。目前，在人類[4]、小鼠[3]、牛[5]、豬[6]和羊[7]等動物的卵泡膜細(xì)胞和GCs 中發(fā)現(xiàn)了瘦素受體。瘦素受體的選擇性剪接可產(chǎn)生 6 種形式的受體（OB-Ra 至 OB-Rf）[8]，其中，OB-Rb 是一種功能性的瘦素受體，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。瘦素受體酪氨酸位點(diǎn)突變的Y123F 小鼠血清E2水平下降、生殖器官不成熟導(dǎo)致不孕以及發(fā)生代謝異常[9]。近年來研究表明，瘦素不僅通過下丘腦/垂體參與促性腺激素的分泌，而且循環(huán)或局部產(chǎn)生的瘦素也可以直接調(diào)節(jié)卵巢功能[10]。瘦素信號結(jié)合跨膜受體OB-Rb 通過Janus 激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK/STAT）途徑發(fā)揮作用[11-12]。當(dāng)Janus 激酶 2（JAK2）被激活時(shí)，OB-Rb 在不同的酪氨酸位點(diǎn)被進(jìn)一步磷酸化，隨后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）通過磷酸化活化形成二聚體，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)[13-14]。目前，瘦素已經(jīng)被證明可以通過JAK2/STAT3 通路抑制人卵泡GCs 中抗繆勒激素mRNA 的表達(dá)[15]。體外添加低濃度瘦素促進(jìn)鵝體內(nèi)GCs 的增殖和抑制GCs 的凋亡[16]，抑制豬體內(nèi)GCs 的凋亡[17]和水牛體內(nèi)GCs 的凋亡[18]。然而，瘦素介導(dǎo)這些變化的機(jī)制以及JAK2/STAT3 是否在這一過程中發(fā)揮作用仍不清楚。

本研究通過添加不同濃度的瘦素處理綿羊卵泡GCs，探討瘦素通過JAK2/STAT3 信號通路對GCs 的調(diào)控作用，旨在為提高雌性動物的繁殖性能提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

在發(fā)情季節(jié)從山西省太原市清徐縣綿羊屠宰基地采集成年、健康雌性綿羊的卵巢。

1.2 主要試劑

重組羊瘦素購自ProSpec 公司，胎牛血清FBS購自CellMax 公司，青鏈霉素混合液、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、MTT 試劑盒、1×PBS 緩沖液（pH 值7.2～7.4）、DAPI、PMSF 均購自北京索萊寶科技有限公司，DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)液購自 HyClone 公司，EdU 細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自RIBOBIO 公司，BSA、Triton X-100 購自 Sigma-Aldrich 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 TaKaRa，JAK2 抗體、P-STAT3 抗體購自 CST 公司，STAT3 一抗購自 ABclonal 公司，Bcl-2一抗、封閉蛋白奶粉、PMSF 均購自博士德生物工程有限公司，F(xiàn)SHR 一抗、β-actin polyclonal antibody購自BioWorld，OB-Rb 抗體購自生物工程（上海）股份有限公司，IRDye800CW Goat anti-Rabbit 購自LI-COR，RIPA 裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞收集

收集卵巢，經(jīng)消毒后置于DPBS 溶液中，在短時(shí)間內(nèi)盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。不同直徑的卵泡中卵泡顆粒細(xì)胞具有不同轉(zhuǎn)錄組譜[19]，在體外培養(yǎng)時(shí)，根據(jù)卵泡的發(fā)育階段，本試驗(yàn)僅從2～5 mm 的卵泡中分離卵泡顆粒細(xì)胞。分離的卵泡用酒精浸泡后置入預(yù)冷的DPBS 中，將卵泡在表面皿中（含DPBS）剪開，沿卵泡內(nèi)壁輕刮，獲取壁層顆粒細(xì)胞，用15 mL 的離心管收集。1 000 r/min 離心5 min，棄去上清，用完全培養(yǎng)基（DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋1%雙抗＋10%FBS）重懸沉淀，離心洗滌2 次，用完全培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞懸液鋪于培養(yǎng)皿，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）培養(yǎng)用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 卵泡顆粒細(xì)胞鑒定 GCs 鋪于12 孔板中，達(dá)到50%左右細(xì)胞融合率時(shí)，棄液體，加入PBS 溶液輕輕晃動細(xì)胞板，洗去多余培養(yǎng)液。4%多聚甲醛固定液室溫孵育30 min，PBS 洗滌后每孔加入1%Triton X-100 溶液 37 ℃通透 30 min，PBS 溶液洗滌后每孔再加入 500 μL 1% BSA 37 ℃封閉 1 h，PBS溶液洗滌。試驗(yàn)孔加入200 μL FSHR 一抗（1∶100稀釋），陰性對照加入200 μL PBS，4 ℃孵育 12 h。PBS 洗滌，綠色熒光二抗避光37 ℃孵育1 h（1∶200 稀釋）。PBS 避光洗滌。每孔滴加DAPI 原液100 μL，37 ℃避光孵育 20 min，PBS 避光洗 4 次，每次5 min。熒光顯微鏡進(jìn)行拍照記錄。

1.4.2 卵泡顆粒細(xì)胞增殖 取生長狀態(tài)旺盛的細(xì)胞接種于24 孔板中，鋪勻，貼壁后，用加入不同濃度瘦素（0、10、25、50、100 ng/mL） 的無血清培養(yǎng)基（DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋1%雙抗）培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，按 1 000∶1 稀釋 EdU 溶液，配制為 50 μmol/L的 EdU，向每孔中加入 500 μL，孵育 2 h，PBS 洗滌1～2 次；4%多聚甲醛固定30 min，棄去液體；添加2 mg/mL 的甘氨酸于試驗(yàn)孔，脫色搖床洗脫5 min，棄去；加入PBS，脫色搖床孵育5 min，棄去；再加入滲透劑（0.5%Triton X-100 的 PBS）搖床孵育 10 min，PBS 洗去多余滲透劑；添加 500 μL1×Apollo 染色反應(yīng)液于試驗(yàn)細(xì)胞孔中，置于搖床上避光處理30 min，棄去反應(yīng)液；加入滲透劑脫色搖床清洗10 min，重復(fù)2～3 次，棄去滲透液；每孔再加入1×Hoechst33342反應(yīng)液，室溫條件下避光搖床孵育30 min，棄去反應(yīng)液；PBS 洗滌1～3 次，使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀測拍照。

1.4.3 qPCR 擴(kuò)增 在6 孔中培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，用加入不同濃度瘦素（0、10、25、50、100 ng/mL）的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞，向培養(yǎng)孔中加入1 mL Trizol，通過抽提、沉淀、溶解等步驟提取RNA。用NanoDrop ND-1000 儀器評估RNA 的質(zhì)量，RNA 樣品的 OD260/OD280值在 1.8～2.0 范圍內(nèi)可使用。使用TaKaRa 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將該cDNA 作為模板進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增。引物序列如表1 所示，由華大基因合成，β-actin作為內(nèi)參基因。依據(jù)Prime ScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser 說明書，反應(yīng)體系為 10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s 進(jìn)行預(yù)變性；95 ℃ 5 s，60 ℃30 s，72 ℃ 15 s，進(jìn)行 45 個(gè)循環(huán)（PCR 反應(yīng)階段）；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s（熔解曲線階段）。

表1 基因引物序列

1.4.4 Western blotting 收集不同濃度瘦素處理24 h后的顆粒細(xì)胞，向每孔加入含有蛋白酶抑制劑PMSF的蛋白裂解液200 μL，低溫裂解30 min，收集樣品。向樣品中加入蛋白上樣緩沖液（體積比4∶1），將樣品混勻離心，在金屬浴中變性10 min，取出后放在冰上等待加樣。通過SDS-PAGE 電泳分離蛋白，依據(jù)Maker 大小，切下含目的蛋白的凝膠，通過轉(zhuǎn)膜程序?qū)⑵滢D(zhuǎn)移至NC 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，用 TBST 稀釋一抗 β-actin（1∶10 000）、JAK2（1∶1 000）、STAT3（1∶500）、Bcl-2（1∶500）、BAX（1∶1 000）、P-STAT3（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。用TBST 稀釋羊抗兔 IgG（1∶18 000），孵育 1 h。采用Odyssey CLX 遠(yuǎn)紅外掃描系統(tǒng)檢測NC 膜結(jié)果，β-actin作為內(nèi)參蛋白進(jìn)行結(jié)果分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

EdU 結(jié)果用Image J 軟件計(jì)數(shù)和分析細(xì)胞增殖數(shù)。qPCR 結(jié)果采用 2-ΔΔCt法計(jì)算靶基因 mRNA 的相對豐度表達(dá)，β-actin為內(nèi)參基因。Western blotting蛋白條帶的灰度值由Image J 軟件分析得出。在保證正態(tài)性和方差齊性后，采用SPSS 22.0 單因素方差分析（ANOVA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，GraphPad Prism 7.0 軟件用于繪圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 顯示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫熒光結(jié)果

卵泡激素受體（FSHR）特異性表達(dá)于卵泡顆粒細(xì)胞，經(jīng)免疫熒光染色的卵泡顆粒細(xì)胞如圖1 所示。由圖1 可知，95%以上的顆粒細(xì)胞表達(dá)FSHR受體，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 顆粒細(xì)胞增殖能力

EdU 檢測細(xì)胞增殖情況如圖2-A 所示。通過Image J 分析表明，與對照組（0 ng/mL）相比，25、50 ng/mL 瘦素處理24 h 后細(xì)胞增殖率顯著升高（P＜0.05）（圖 2-B）。

2.3 瘦素對相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖3 可知，與對照組（0 ng/mL）相比，添加不同濃度瘦素后，LEPR、JAK2的mRNA 表達(dá)均顯著提高（P＜0.05），抑凋亡基因Bcl-2在添加100 ng/mL瘦素后表達(dá)升高（P＜0.05），促凋亡基因BAX在添加 25、50 ng/mL 瘦素后表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。Bcl-2/BAX在 25、50 ng/mL 瘦素時(shí)表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

2.4 瘦素對相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

在蛋白水平，與對照組（0 ng/mL）相比，加入不同濃度瘦素后，LEPR 在 25、50 ng/mL 時(shí)表達(dá)顯著升高，JAK2 在50 ng/mL 時(shí)表達(dá)顯著升高，STAT3在 25、50 ng/mL 時(shí)表達(dá)顯著升高，P-STAT3 表達(dá)在50 ng/mL 時(shí)顯著增加（P＜0.05），Bcl-2 在 50 ng/mL時(shí)表達(dá)量顯著升高（圖4）。

3 結(jié)論與討論

卵泡GCs 是卵泡的功能細(xì)胞，GCs 凋亡可引發(fā)卵泡閉鎖的發(fā)生。當(dāng)發(fā)生卵泡閉鎖時(shí)，GCs 凋亡率明顯升高，在小卵泡中表現(xiàn)明顯[20-21]，凋亡相關(guān)基因Bcl-2 和BAX 的比值呈現(xiàn)顯著下降趨勢[22]，進(jìn)一步說明GCs 凋亡可用于評價(jià)卵泡健康狀況。卵泡GCs具有強(qiáng)大的分泌功能。卵母細(xì)胞可以通過它們之間的間質(zhì)連接獲得必要的營養(yǎng)，以發(fā)育成熟[23]。

本研究表明，外源瘦素對綿羊GCs 的生長有促進(jìn)作用。EdU 結(jié)果顯示，與對照組相比，25 ng/mL 或50 ng/mL 瘦素促進(jìn) GCs 增殖。據(jù)報(bào)道，10 ng/mL 瘦素可促進(jìn)鵝卵泡GCs 增殖[16]，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，但瘦素濃度略有不同，可能是由于物種差異所致。100 ng/mL 瘦素促進(jìn)Bcl-2基因的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡過程中Bcl-2/BAX值可間接反映細(xì)胞的凋亡被抑制程度，25 ng/mL 或50 ng/mL 瘦素作用于GCs 時(shí)，Bcl-2/BAX值升高，證明細(xì)胞凋亡被抑制。瘦素的抑凋亡作用也在OVCAR-3 卵巢癌細(xì)胞上被證實(shí)，這可能是由于增殖相關(guān)基因表達(dá)的增加和促凋亡相關(guān)基因表達(dá)的降低[24]。轉(zhuǎn)染Leptin-siRNA 于人卵巢 GCs 24 h 后，GCs 增殖減弱，Bcl-2表達(dá)受到抑制，BAX表達(dá)增強(qiáng)[25]，與本研究結(jié)果相反，沉默瘦素基因表達(dá)后，凋亡基因表達(dá)改變，從相反的角度驗(yàn)證了本研究的結(jié)果。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中添加25 ng/mL瘦素培養(yǎng)綿羊腔前卵泡時(shí)，可提高卵泡的發(fā)育以及卵母細(xì)胞成熟率[26-27]，卵泡體外存活率的提高可能與瘦素對卵泡GCs 的作用有關(guān)。體外培養(yǎng)液中添加25 ng/mL 瘦素與本試驗(yàn)結(jié)果得出的25 ng/mL 的瘦素對GCs 的增殖作用一致。牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)液中加入1 000 ng/mL 瘦素，受精后第5 天成熟卵母細(xì)胞發(fā)育到8- 細(xì)胞期的百分率高于對照組[28]。PANDA 等[27]也研究表明，在水牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)基中添加瘦素可提高卵裂率和囊胚率，獲得高質(zhì)量的卵母細(xì)胞。短期優(yōu)化飼養(yǎng)綿羊血清中瘦素水平提高，可增加卵泡GCs 中OB-Rb 的表達(dá)，使卵泡在最后一個(gè)非排卵波中的存活時(shí)間延長[29]。本試驗(yàn)也證明，體外培養(yǎng)體系中瘦素濃度的增加可增加LEPR的表達(dá)。綜上所述，目前和以往的研究表明，瘦素在調(diào)節(jié)卵巢GCs 生長中起著重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞發(fā)生增殖、凋亡或進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)過程中，JAK2/STAT3 通路都參與其中[30]。瘦素通過JAK2/STAT3 途徑調(diào)節(jié)針對視前黑素皮質(zhì)素（POMC）神經(jīng)元 mRNA 的 miRNAs 的表達(dá)[31]。瘦素還通過JAK2/STAT3 途徑對小鼠腦缺血再灌注損傷和氧糖剝奪（OGD）原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)具有神經(jīng)保護(hù)作用[32]。瘦素通過JAK2/STAT3 信號途徑促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的生長和遷移[33]。本研究對綿羊GCs 增殖過程中瘦素與JAK2/STAT3 信號通路之間的相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證。通過檢測與JAK2/STAT3通路相關(guān)的JAK2 和STAT3 信號分子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) LEPR、JAK2、STAT3 和 P-STAT3 在 mRNA 和蛋白表達(dá)上增加，說明外源性瘦素處理激活了綿羊GCs 中的JAK2/STAT3 信號通路，可以進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，瘦素促進(jìn)卵泡GCs 的增殖，提高了Bcl-2/BAX值，其中，50 ng/mL 瘦素對 GCs 的促增殖抑凋亡作用最佳。同時(shí)，瘦素提高了GCs 中瘦素受體的表達(dá)，激活了JAK2/STAT3 通路。