小麥條銹菌侵染過程中小麥質(zhì)外體中糖的定量分析

劉秀峰 ，楊兆順 ，樓辰軍 ，許高平 ，邵鳳武

（1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物研究所，天津300381；2.天津市農(nóng)作物遺傳育種重點(diǎn)實驗室，天津300381）

由條形柄銹菌小麥?；停≒uccinia striiformisf.sp.tritici，Pst）引起的小麥條銹病是一種重要的病害，其會造成小麥產(chǎn)量損失巨大[1-2]，在我國曾發(fā)生多次大流行，嚴(yán)重危害小麥生產(chǎn)安全[3-5]。Pst需要從寄主小麥獲取包括糖類在內(nèi)的多種營養(yǎng)物質(zhì)用于菌體生長發(fā)育，目前對Pst吸收小麥糖類的機(jī)理并不清楚?，F(xiàn)在已經(jīng)明確，包括Pst在內(nèi)的活體營養(yǎng)專性寄生真菌在侵染寄主過程中由菌絲高度特化形成吸器，同位素標(biāo)記飼喂以及轉(zhuǎn)錄表達(dá)數(shù)據(jù)均表明吸器具有吸收寄主營養(yǎng)物質(zhì)的功能[6-8]。顯微結(jié)果表明，Pst吸器穿透小麥細(xì)胞壁后并未真正破壞小麥細(xì)胞質(zhì)膜，而是被小麥細(xì)胞質(zhì)膜形成的鞘所包裹，其吸器頸處會產(chǎn)生一個頸環(huán)連同吸器外基質(zhì)形成一個特殊封閉的質(zhì)外體[9]。已有研究結(jié)果表明，質(zhì)外體是植物病原菌與寄主競爭糖類的重要場所，病原菌侵入寄主質(zhì)外體干擾寄主糖信號傳導(dǎo)，調(diào)控被侵染組織成為強(qiáng)力的庫器官，促使寄主植物源器官產(chǎn)生的糖類物質(zhì)流向菌體侵入的組織，造成有利于病原菌侵染繁殖的環(huán)境[10-14]。目前，小麥質(zhì)外體中糖濃度的變化與Pst致病性的關(guān)系尚未報道。

本研究根據(jù)Pst吸器的頸環(huán)封閉形成獨(dú)立的特殊質(zhì)外體的特點(diǎn)，分別提取貴農(nóng)22 和雜46 葉片質(zhì)外體溶液，定量分析Pst接種后 0、1、2、3、4、8、14 d小麥質(zhì)外體中葡萄糖濃度，旨在明確小麥質(zhì)外體中糖濃度的變化與Pst致病性的關(guān)系，為探究Pst獲取小麥糖類的關(guān)鍵基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試小麥條銹菌（Puccinia striiformisf.sp.tritici）為CYR32，小麥條銹菌繁殖品種為銘賢169。供試小麥分別為雜46（感）和貴農(nóng)22（抗）。

1.2 試驗主要試劑與儀器

主要試劑為葡萄糖-6- 磷酸脫氫酶（G6PDH）、D- 己糖-6- 磷酸轉(zhuǎn)移酶（HKX）、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）、二硫蘇糖醇（DTT）、還原型 β- 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽（β-NADH 二鈉）、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、牛血清白蛋白（BSA）、草酰乙酸、山梨糖醇等，均購自Sigma 公司。酶標(biāo)儀及Softmaxpro軟件購自美谷分子儀器有限公司（MolecularDevices）。

1.3 試驗方法

1.3.1 小麥條銹菌接種及小麥葉片質(zhì)外體溶液提取 22 ℃（光/暗為16 h/8 h）恒溫培養(yǎng)至雜46 和貴農(nóng)22 第7 葉完全展開，用微型噴霧器分別噴霧接種小麥條銹菌CYR32 孢子懸浮液（0.125 mg/mL），分別組成親和組合和非親和組合。以蒸餾水噴霧雜46 和貴農(nóng)22 為對照。10 ℃下黑暗保濕24 h，然后蓋上隔離罩放置于人工氣候室內(nèi)，22 ℃下（光/暗為 16 h/8 h）培養(yǎng)。取接種后 0、1、2、3、4、8、14 d 完整的小麥葉片，用75%酒精輕輕擦拭各處理小麥葉片表面，參照PERIYANNAN 等[15]的方法室溫下提取質(zhì)外體溶液；收集質(zhì)外體溶液后取5 μL 進(jìn)行糖的定量分析，2 μL 檢測細(xì)胞質(zhì)污染，其余部分放于-20 ℃保存。

1.3.2 小麥質(zhì)外體中葡萄糖濃度分析 酶標(biāo)板每孔加入 5 μL 小麥質(zhì)外體溶液和 185 μL 新鮮配置的 HEPES 緩沖液（100 mmol/L HEPES，pH 值 7.5，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT，0.02%（m/V）BSA，8 mmol/L NAD+，4 mmol/L ATP）混合均勻后340 nm下測量吸光值，記錄穩(wěn)定吸光值A(chǔ)0。葡萄糖含量分析參照 SCHOLES 等[16]和 PERIYANNAN 等[15]的方法進(jìn)行。

1.3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制作 葡萄糖在HKX催化下與ATP 發(fā)生磷酸化反應(yīng)，生成葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）和二磷酸腺苷二鈉（ADP），其中，G-6-P在G6PDH 催化下脫氫生成6- 磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯，并使NAD+還原成NADH。該反應(yīng)中葡萄糖的消耗與NADH 的生成呈等摩爾關(guān)系，NADH 在340 nm處有特征吸收峰。將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行反應(yīng)一定時間，終止時NADH 的摩爾數(shù)等于葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的摩爾數(shù)，測定其吸光值即可求得實際摩爾吸光系數(shù)。

精確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品并配置成終濃度分別為 0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、1.00 mmol/L 的溶液，分別取5 μL 按照1.2.2 方法測量吸光值，繪制圖形，計算線性回歸方程。

1.3.4 質(zhì)外體溶液的細(xì)胞質(zhì)污染檢測 提取小麥葉片質(zhì)外體溶液時可能發(fā)生細(xì)胞質(zhì)膜受損，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)污染提取液。為評估細(xì)胞質(zhì)污染的影響，本研究根據(jù)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蘋果酸在蘋果酸脫氫酶作用下生成草酰乙酸，NADH 氧化脫氫導(dǎo)致340 nm 下吸光值下降，對細(xì)胞質(zhì)污染率進(jìn)行了檢測。質(zhì)外體溶液中細(xì)胞質(zhì)污染檢測采用蘋果酸脫氫酶測定方法進(jìn)行。分別取100 mg 未接種或接種Pst的小麥葉片，加入1 mL 0.2 mol/L 山梨糖醇研磨，作為100%細(xì)胞質(zhì)污染對照。酶標(biāo)板每孔加入2 μL 研磨所得濾液或小麥質(zhì)外體溶液和196 μL 蘋果酸脫氫酶緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，0.1 mmol/L β-NADH 二鈉），340 nm 下測定吸光值，記錄穩(wěn)定吸光值為A1CK或A1樣品。然后每孔加入 2 μL 草酰乙酸，記錄穩(wěn)定的吸光值為A2CK或A2樣品。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 統(tǒng)計插件PHStat v 4.1處理；采用Duncan 氏新復(fù)極差法測驗法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品工作曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 3 次重復(fù)配置的 0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、1.00 mmol/L 溶液的吸光值平均值分別為 0.007 8、0.011 7、0.014 1、0.037 3、0.077 4、0.103 8，各濃度吸光度最小值和最大值分別為0.003 7 和 0.014 9、0.008 9 和 0.016 4、0.010 3 和0.019 3、0.031 5 和 0.043 5、0.070 1 和 0.082 8、0.087 4和0.122 0。吸光度—葡萄糖濃度呈線性部分的擬合方程為y＝8.892 0x＋0.018 1（R2＝0.965 6）（圖 1）。

2.2 受Pst 侵染的小麥質(zhì)外體中葡萄糖的濃度變化

雜46 和貴農(nóng)22 在蒸餾水噴霧、接種CYR32后 0、1、2、3、4、8、14 d 提取的質(zhì)外體溶液中細(xì)胞質(zhì)污染率最大為0.293 7，最小為0.125 9；總體上，對照貴農(nóng)22 和雜46 蒸餾水噴霧后0～3 d 的細(xì)胞質(zhì)污染率差異顯著（P＜0.05），接種后3～14 d 各處理的細(xì)胞質(zhì)污染率差異不顯著（表1），各處理間的細(xì)胞質(zhì)污染率未呈現(xiàn)規(guī)律性變化。

表1 接種CYR32 后提取的質(zhì)外體溶液中細(xì)胞質(zhì)污染率

由圖2 可知，對照蒸餾水噴霧處理后0、1、2、3、4、8、14 d 貴農(nóng) 22 和雜 46 質(zhì)外體中葡萄糖濃度波動幅度較小，均未出現(xiàn)明顯的濃度峰值，平均值分別為0.047 3、0.053 0 mmol/L；葡萄糖最高濃度分別為 0.056 3、0.066 6 mmol/L，最低濃度分別為0.035 9、0.036 2 mmol/L。貴農(nóng)22- 蒸餾水與雜46-蒸餾水的質(zhì)外體中葡萄糖濃度差異不顯著。

雜 46 接種 CYR32 后 0、1、2、3、4、8、14 d 質(zhì)外體中葡萄糖濃度呈現(xiàn)明顯的波動，接種后0～3 d濃度急劇升高，接種后3 d 葡萄糖濃度達(dá)最高值（1.006 9 mmol/L），是接種后 0 d 濃度（0.047 4 mmol/L）的21.23 倍；接種后4 d 濃度約為最高值的1/3（0.325 8 mmol/L），隨后小幅升高；接種后14 d 濃度（0.412 8 mmol/L）約為最高值的0.41 倍。貴農(nóng)22 接種 CYR32 后 0、1、2、3、4、8、14 d 葉片質(zhì)外體中葡萄糖濃度平均值為0.223 0 mmol/L，接種后2 d 葡萄糖濃度從0.077 1 mmol/L（接種后0 d）上升到最高值0.412 2 mmol/L（接種后 2 d），為雜 46 接種 CYR32濃度峰值的0.41 倍；接種后3 d 濃度略有下降（0.386 7 mmol/L），隨后濃度下降為該組合濃度峰值的0.38 倍，并保持相對穩(wěn)定至接種后14 d（圖2）。CYR32 接種的組合均與對照蒸餾水處理的組合質(zhì)外體中葡萄糖濃度差異顯著（P＜0.05）；雜46 與貴農(nóng)22 接種CYR32 后質(zhì)外體中葡萄糖濃度除接種后0、2 d 外其余時間點(diǎn)差異均顯著（P＜0.05）。

3 結(jié)論與討論

目前，對Pst如何從小麥寄主將糖類吸收進(jìn)入菌體尚不清楚。在大麥柄銹菌Puccinia hordei-大麥、白銹菌Albugo candida-擬南芥、玉米黑粉菌Ustilago maydis-玉米、黃曲霉菌Aspergillus flavus- 玉米等多種病原菌- 寄主互作中，均檢測到蔗糖酶基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)和蔗糖酶表達(dá)量明顯增加[17-19]。最近研究發(fā)現(xiàn)，Pst中編碼蔗糖酶的PsINV基因在Pst- 小麥親和與非親和互作中均大量表達(dá)，該基因產(chǎn)物可以高效分解蔗糖[20]。蔗糖酶主要功能是將蔗糖水解成葡萄糖和果糖，Pst侵染過程中蔗糖酶基因表達(dá)量增加可能有利于Pst將小麥質(zhì)外體中的蔗糖分解成葡萄糖和果糖。Pst基因組中已發(fā)現(xiàn)編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因[21]，但未發(fā)現(xiàn)預(yù)測編碼果糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，因此，Pst分解蔗糖產(chǎn)生的果糖累積可能將激發(fā)小麥的抗性反應(yīng)。筆者發(fā)現(xiàn)，Pst侵染過程中預(yù)測編碼磷酸葡萄糖變位酶、甘露糖-1- 磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶等與糖代謝相關(guān)的基因被誘導(dǎo)高度表達(dá)并且在不同毒力菌株間表達(dá)差異顯著，甘露糖-1- 磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶具有專化的轉(zhuǎn)運(yùn)甘露糖功能。如果果糖在變位酶、甘露糖-1- 磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶等催化下轉(zhuǎn)化為甘露糖，甘露糖-1- 磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)運(yùn)甘露糖，進(jìn)而在甘露醇脫氫酶作用下還原為甘露醇，既避免了由于果糖與蔗糖的比例升高介導(dǎo)的小麥抗性，又可以將產(chǎn)生的甘露醇作為病原菌的碳源儲備和淬滅寄主的活性氧。Pst如何調(diào)節(jié)小麥質(zhì)外體中糖濃度和比例使之有利于菌體生長發(fā)育還需要進(jìn)一步研究。

質(zhì)外體是植物細(xì)胞間營養(yǎng)交流的基礎(chǔ)空間，也是成功侵染的病原菌獲取寄主糖類的重要場所。目前研究表明，受病原菌侵染的寄主植物質(zhì)外體中的糖變化與其抗性表型相關(guān)，例如葡萄受到白粉菌Plasmopora viticola和霜霉菌Erysiphe cichoracearum侵染時質(zhì)外體中糖含量降低限制了病原菌擴(kuò)散[22]。受玉蜀黍黑粉菌Ustilago maydis侵染的玉米葉片中糖減少激發(fā)了水楊酸介導(dǎo)的對Ustilago maydis的抗性[23]。與此相似，本研究顯示，感病和抗病小麥接種Pst后質(zhì)外體中葡萄糖濃度均發(fā)生動態(tài)變化，但抗病小麥比感病小麥的質(zhì)外體中葡萄糖濃度低，感病的雜46 接種后4 d 質(zhì)外體中葡萄糖濃度從0.047 4 mmol/L 急劇升高到1.006 8 mmol/L，接種后14 d 葡萄糖濃度雖然比峰值時下降，但依然高于蒸餾水噴霧的雜46 質(zhì)外體中葡萄糖濃度。而抗CYR32 的貴農(nóng)22 接種后葉片質(zhì)外體中葡萄糖濃度雖然也表現(xiàn)升高，但峰值僅為雜46 接種后峰值的0.41 倍?？剐孕←?zhǔn)欠裢ㄟ^降低質(zhì)外體中葡萄糖濃度限制Pst獲取糖類，還需要結(jié)合Pst糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)等進(jìn)一步研究。