綿羊肺炎支原體貴州株 P30 基因的遺傳進化分析

萬孝雪， 吳 燕， 楊 鵬， 郭小江， 肖 麗， 吳斌鳳， 羅小芬， 程振濤，2*， 李鳳龍

(1. 貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州 貴陽 550025； 3. 貴州省草地技術試驗推廣站，貴州 貴陽 550025； 4.遵義市紅花崗區(qū)海龍鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務中心，貴州 遵義 563000)

綿羊肺炎支原體(Mycopiasmaovipneumoniae，Mo)是引起綿羊和山羊慢性呼吸道疾病的主要病原之一，發(fā)病癥狀及病理變化以喘氣、咳嗽、漸進性消瘦、慢性增生性間質(zhì)性肺炎為主[1]。1963年，Mackey J M K等[2]首次于綿羊胸膜肺炎病例中分離出Mo。后來經(jīng)過Carmicheal L E等[3]證明了Mo的致病性，并引起世界各國的廣泛關注?，F(xiàn)已證實綿羊支原體肺炎呈全球性分布[4]。由于感染Mo后康復的綿羊和山羊也會長期攜帶此致病原，因此徹底控制和消滅此病較難，給養(yǎng)羊業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[5]。目前藥物治療綿羊支原體肺炎效果不佳，而綿羊肺炎支原體培養(yǎng)非常困難，產(chǎn)量低，疫苗制作成本高，疫苗實際預防效果也不理想，還沒有可廣泛應用的Mo疫苗。至今Mo疫苗在靶標基因的選擇上仍存在很多困難，已公布完成全基因組測序的近緣物種僅有綿羊肺炎支原體四川分離株(Mo SC01)，而研究Mo免疫原蛋白及抗原組分的報道也較少。綿羊肺炎支原體Y98標準株(Mo Y98)存在4種主要蛋白抗原，相關研究顯示Mo與豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)的70、50、40、25 ku蛋白存在共同抗原[6]。此外相關研究表明，Mo的 30 ku 蛋白P30具有良好的免疫原性[7]。本文通過MoP30基因擴增、克隆測序和序列分析，了解4株Mo貴州分離株P30基因的進化情況，為核酸疫苗靶標基因的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株Mo Y98(CVCC 384)標準株，由貴州大學預防獸醫(yī)實驗室保存；Mo貴州分離株(GZQX、GZXS、GZHZ、GZKY)，由貴州大學預防獸醫(yī)實驗室分離并保存。

1.2 主要試劑細菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；2×TaqPCR MasterMix、DL 2 000 bp DNA Marker、pMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶(BamH Ⅰ、HindⅢ)，購自TaKaRa公司；E.Z.N.ATMGel Extraction Kit膠回收試劑盒、E.Z.N.ATMPlasMid Kit質(zhì)粒提取試劑盒，購自Omega公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器T20型雙槽梯度PCR儀，購自杭州朗基科學儀器有限公司；Tanon 1600全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)，購自上海天能公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，購自常州金壇良友儀器有限公司。

1.4P30基因的擴增

1.4.1 引物設計與合成參照GenBank的Mycoplasmahyopneumoniae7422外膜蛋白P30基因序列信息，設計合成引物MoP30基因特異性引物Mo-F/R(見表1)，送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.4.2 Mo基因組DNA的提取對Mo Y98標準株和Mo貴州分離株(GZQX、GZXS、GZHZ、GZKY)進行培養(yǎng)，參照DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取，提取物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 MoP30基因PCR擴增采用PCR技術，分別以4株Mo貴州株和Mo Y98標準株DNA為模板，擴增MoP30基因。建立反應體系25 μL：引物Mo-F/R (10 μmol/L)各1 μL，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，模板DNA 2.5 μL，ddH2O 8.0 μL。充分混勻，按下列反應程序進行目的基因PCR擴增：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸80 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取 PCR產(chǎn)物8 μL于1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察目的基因擴增情況(預擴增片段884 bp)。

1.5 MoP30基因克隆與測序參照E.Z.N.ATMGel Extraction Kit 膠回收試劑盒說明書進行目的基因膠回收純化。向PCR管中加入已純化的PCR產(chǎn)物4.0 μL、pMD-19T載體1.0 μL、Solution連接酶5.0 μL，構建連接體系10 μL，16 ℃連接過夜；將連接產(chǎn)物10 μL加入大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α)50 μL，混勻后依次冰浴30 min，42 ℃熱沖擊90 s，冰浴3 min，最后加入經(jīng)37 ℃預熱的LB液體培養(yǎng)基至總體積1 mL混勻，37 ℃震蕩培養(yǎng)1 h后涂布于含氨芐青霉素鈉(Amp)的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)16 h后挑選單個菌落進行培養(yǎng)。取培養(yǎng)菌液提取質(zhì)粒DNA，以質(zhì)粒DNA為模板按1.4.3方法進行重組質(zhì)粒PCR鑒定，構建雙酶切體系30 μL：重組質(zhì)粒17.0 μL、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ 1.0 μL和HindⅢ2.0 μL、10×Buffer R 2.0 μL、ddH2O 8.0 μL，進行重組質(zhì)粒雙酶切鑒定。將PCR鑒定及雙酶切鑒定結果均為陽性的質(zhì)粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序鑒定。

1.6P30基因序列測定與分析利用primer 5.0軟件將4株Mo貴州株P30基因序列與Mo Y98標準株、GenBank中12株其他支原體的P30基因進行核苷酸序列多重對比；構建系統(tǒng)進化樹，利用MEGA 5.0 軟件分析基因同源性及系統(tǒng)進化關系。參考菌株信息(見表2)。

表2 參考菌株序列

2 結果

2.1 MoP30基因擴增結果由圖1可見：PCR擴增出長度約884 bp的清晰條帶，與預期擴增片段相符。

M：DNA標準分子質(zhì)量； 1、2：Mo Y98 株； 3：GZQX株；4：GZXS株； 5：GZHZ株； 6：GZKY株； 7：陰性對照圖1 P30基因PCR擴增結果

2.2 目的基因克隆結果由圖2可見：重組質(zhì)粒pMD19T-P30PCR擴增產(chǎn)物含884 bp的特異性條帶，雙酶切產(chǎn)物為載體條帶(2 692 bp)和目的條帶(884 bp)，說明P30基因已插入pMD19-T載體。

2.3 MoP30基因變異性分析結果由圖3可見：4株 Mo貴州株與Mo Y98標準株序列比對，GZXS株在第58位、59位出現(xiàn)缺失，第758位堿基出現(xiàn)突變；GZHZ株在第63位出現(xiàn)缺失，第684位、825位出現(xiàn)堿基突變；GZKY株在第63位、763位、781位、803位、818位、819位、836位、848位、879位共9處位置出現(xiàn)缺失，在第691位、814位、815位、817位處出現(xiàn)堿基突變；GZQX株僅在第63位處發(fā)生1個基因缺失。結果提示Mo貴州株存在部分基因缺失或突變，但數(shù)量較少。

圖3 P30基因序列比對結果

2.4 MoP30基因同源性分析結果由圖4 可見：4株Mo貴州株與Mo Y98標準株的P30基因序列相似性達94.9%以上。其中GZQX株與Mo Y98標準株同源性最高，達到99.4%；GZKY株與Mo Y98標準株同源性最低，為94.9%。Mo貴州株與Mo SC01同源性在72.2%～76.3%之間；與豬肺炎支原體(Mhp 168-L、Mhp 168、Mhp 7448、Mhp 232、Mhp 7422)P30基因同源性在72.9%～78.0%之間；與絮狀支原體(Mf ATCC)P30基因同源性在73.5%～79.8%之間；與其他種支原體同源性均在30.0%以下。結果提示MoP30基因具有良好的種屬特異性。

圖4 Mo貴州株與參考菌株基因序列同源性注：左下角數(shù)據(jù)為遺傳距離，右上角數(shù)據(jù)為同源性

2.5 MoP30基因進化樹分析由圖5可見：4株Mo貴州株與Mo Y98標準株處于同一進化分支，親緣關系最近；與牛支原體(Mbov)、雞毒支原體(Mgalli 8750)親緣關系次之；與Mo SC01、絮狀支原體(Mf ATCC)、豬肺炎支原體(Mhp 168-L、Mhp 168、Mhp 7448、Mhp 232、Mhp 7422)、肺炎支原體(Mp 309)親緣關系較遠。Mo SC01與豬肺炎支原體(Mhp 168-L、Mhp 168、Mhp 7448、Mhp 232、Mhp 7422)處于同一進化分支，親緣關系最近。

圖5 Mo貴州株與參考菌株核酸序列系統(tǒng)進化樹

3 結論

本試驗運用前期分離出的Mo貴州株(GZHZ、GZKY、GZQX、GZXS)通過PCR技術擴增Mo貴州株膜蛋白P30基因，將擴增序列與標準菌株Mo Y98P30基因序列進行比對，通過同源性分析發(fā)現(xiàn)Mo貴州株與Mo Y98標準株同源性較高，在94%以上；遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)Mo貴州株與Mo Y98標準株處于同一遺傳進化分支；基因變異性分析發(fā)現(xiàn)Mo貴州株與Mo Y98標準株相比發(fā)生部分堿基的缺失和(或)突變，但總體非常保守。相關研究表明，Mo Y98標準株P30蛋白具有很好的免疫原性[7]，豬肺炎支原體P30蛋白也具有很好的抗原性[8]。本研究通過分析發(fā)現(xiàn)Mo貴州株P30基因與Mo Y98標準株P30基因、豬肺炎支原體P30基因同源性高，遺傳進化關系近。綜合上述分析認為，Mo貴州株P30基因可作為基因工程疫苗的候選靶標基因。