HIV抗體酶聯(lián)免疫試劑性能驗(yàn)證

魏小文，付繼紅，歐陽良，屈海琴，周愛華，樊華奔，皮麗，吳蘭，方麗娟

（江西迪安華星醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司，江西 南昌 330000 ）

0 引言

獲得性免疫缺陷綜合征，簡稱艾滋病，是由于人類免疫缺陷病毒感染以后所引起的傳染病。人類免疫缺陷病毒（HIV）抗體的血清學(xué)篩查試驗(yàn)方法常用的有ELISA、CLIA、免疫滲慮層析試驗(yàn)等。人類免疫缺陷病毒（HIV）抗體的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是診斷艾滋病的重要依據(jù)，一般使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）作為篩查方法[8]，由于該疾病的特殊性，如何保證患者能有效檢出，主要取決于診斷試劑的性能，所以對(duì)HIV酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒性能情況進(jìn)行確認(rèn)。

1 一般資料

依據(jù)CNAS-CL02-A004《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在臨床免疫學(xué)定性領(lǐng)域的應(yīng)用說明》的要求，對(duì)試劑盒的符合率（采用國家標(biāo)準(zhǔn)血清盤），精密度（包括重復(fù)性和中間精密度）、檢出限（采用康徹斯坦的質(zhì)控品）進(jìn)行性能驗(yàn)證試驗(yàn)[2]

1.1 材料與方法

1.1.1 儀器

安圖酶標(biāo)儀PHOMO、華科瑞HW209696孔洗板機(jī)、生物安全柜BSC-1100ⅡA2-X，以上儀器均由廣州廣電計(jì)量檢測(cè)股份有限公司進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.1.2 試劑

北京萬泰人類免疫缺陷病毒抗體診斷試劑盒（批號(hào)：I20191234）。

1.1.3 質(zhì)控品

1.1.3.1 室內(nèi)質(zhì)控品(濃度: 0.5NCU/mL，北京康徹思坦生物有限公司，批號(hào)201912005) ；

1.1.3.2 HIV抗體血清參考盤（批號(hào)：201901001，有效期至20210123），HIV抗體血清參考盤陰性10份，陽性10份，共20份。

1.2 方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 陰陽符合率HIV抗體血清參考盤陰性10份，陽性10份，共20份樣本，隨機(jī)每4份成一組[1]按下式計(jì)算：陰性符合率%=（驗(yàn)證方法與血清盤一致的陰性結(jié)果÷10）×100%。陽性符合率%=（驗(yàn)證方法與血清盤一致的陽性結(jié)果÷10）×100%。待評(píng)價(jià)方法與血清盤的陰性符合率及陽性符合率均應(yīng)≥95%，驗(yàn)證通過。

1.2.2 精密度試驗(yàn)

1.2.2.1 重復(fù)性精密度所選樣本至少有一個(gè)在臨界值附近，采用接近臨界原倍質(zhì)控稀釋3.5倍作為水平一、原倍質(zhì)控作為水平二兩個(gè)濃度水平，兩水平各重復(fù)檢測(cè)20次，驗(yàn)證批內(nèi)重復(fù)性，計(jì)算S/CO的均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)（CV）。要求批內(nèi)CV<10%，則驗(yàn)證通過[4-5]。

1.2.2.2 中間性精密度所選樣本至少有一個(gè)在臨界值附近，采用接近臨界原倍質(zhì)控稀釋3.5倍作為水平一、原倍質(zhì)控作為水平二兩個(gè)濃度水平，每天檢測(cè)1個(gè)批次，2個(gè)濃度，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定2次，連續(xù)10天(第1天兩水平重復(fù)檢測(cè)20次，驗(yàn)證批內(nèi)重復(fù)性)，計(jì)算S/CO的均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)（CV）。要求批間CV<15%，則驗(yàn)證通過[4-5]。

1.3 檢出限

將選擇的康徹思坦標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.5NCU/mL稀釋到略高于臨界值濃度（其S/CO值在cutoff值附近），每個(gè)稀釋度每天重復(fù)測(cè)定4次，連續(xù)測(cè)定5天，以19次以上結(jié)果為陽性，其濃度為檢出限，也即C95濃度。判定標(biāo)準(zhǔn)：LOD（檢出限）=已知原倍陽性質(zhì)控濃度/稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 陰陽符合率用試劑盒檢測(cè)HIV抗體血清參考盤的陰性和陽性樣本，樣品的檢測(cè)結(jié)果陰陽符合率均為100%，具有可比性。（表1）

表1 北京萬泰酶聯(lián)免疫試劑HIV陰陽性符合率（HIV抗體血清參考盤201901001）

2.2 精密度驗(yàn)證

2.2.1 重復(fù)性精密度

檢測(cè)濃度為0.5NCU/mL稀釋3.5倍質(zhì)控和原倍質(zhì)控的CV%分別為3.97%和3.65%小于廠家試劑盒說明書給的參考值（≤10%），驗(yàn)證通過。（表2）

表2 北京萬泰HIV試劑盒批內(nèi)重復(fù)性精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.2.2 中間性精密度

檢測(cè)濃度為0.5NCU/mL稀釋3.5倍質(zhì)控和原倍質(zhì)控的CV%為 9.05%和7.21%；CV%小于廠家試劑盒說明書聲明的 15%，驗(yàn)證通過。（表3）

表3 北京萬泰HIV試劑盒批間中間精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.3 檢出限

用生理鹽水將康徹思坦標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.5NCU/mL稀釋為6.5、7、7.25、7.5倍，每個(gè)稀釋度每天重復(fù)測(cè)定4次，連續(xù)測(cè)定5天，以19次以上結(jié)果為陽性，計(jì)算每個(gè)濃度標(biāo)本檢測(cè)所得S/CO的均值，檢出限，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋7倍時(shí)的濃度為檢出限，其值為0.07NCU/mL，對(duì)應(yīng)的S/CO均值為1.12。（表4）

表4 北京萬泰酶聯(lián)免疫試劑HIV試劑盒檢出限驗(yàn)證

3 討論

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是HIV主要的篩查方法，試劑盒質(zhì)量是直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的主要因素，為盡可能避免漏檢和假陽性結(jié)果，在選擇使用試劑之前應(yīng)該對(duì)其性能指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)估，從而確定性價(jià)比高，質(zhì)量穩(wěn)定的試劑。

我們參考CNAS-GL038：2019《免疫定性檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，制定了人類免疫缺陷病毒（HIV）抗體ELISA定性檢驗(yàn)方法和程序分析性能驗(yàn)證方案。

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)選用的北京萬泰HIV酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行陰陽符合率、精密度（重復(fù)性和中間精密度）、檢出限進(jìn)行了驗(yàn)證。檢測(cè)試劑盒的陰陽符合率是評(píng)估試劑盒性能和質(zhì)量的重要指標(biāo)[6-7]，本實(shí)驗(yàn)室的陰陽符合率是通過對(duì)HIV抗體血清參考盤檢測(cè)來驗(yàn)證，陰陽符合率均為100%，驗(yàn)證通過，保障結(jié)果的安全性和準(zhǔn)確性。

《WST505-2017定性測(cè)定性能評(píng)價(jià)指南》中指出“評(píng)價(jià)定性檢測(cè)試劑或系統(tǒng)精密度時(shí)，應(yīng)采用濃度接近臨界值的分析物作為檢測(cè)材料，不宜采用陰性低值或強(qiáng)陽性樣本來評(píng)價(jià)定性檢測(cè)方法的不精密度”[3]本實(shí)驗(yàn)室重復(fù)性精密度檢測(cè)CV%分別為 3.97%和3.65%；中間精密度試驗(yàn)的 CV%為 9.05%和7.21%，均驗(yàn)證通過。說明試劑盒的穩(wěn)定性和重復(fù)性均較好。

最低檢測(cè)限是可檢測(cè)出的最低分析物的濃度，所以在試劑正式應(yīng)用于檢測(cè)患者樣本前，確定試劑盒的檢出限是尤為重要的。從檢測(cè)結(jié)果中可以看到，本實(shí)驗(yàn)室所使用的北京萬泰HIV酶聯(lián)免疫試劑盒的檢出限為 0.07NCU/mL。能有效避免假陰性和假陽性。

為了使性能驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果可靠，本實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)前做了準(zhǔn)備很充分：

（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)施及環(huán)境進(jìn)行規(guī)劃和整改，達(dá)到符合生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)要求；

（2）試驗(yàn)所用的儀器均經(jīng)過校準(zhǔn)，各項(xiàng)性能指標(biāo)合格試驗(yàn)要求；

（3）承擔(dān)性能驗(yàn)證的操作人員經(jīng)過崗前培訓(xùn)，熟悉性能驗(yàn)證方案及儀器性能，質(zhì)量控制，操作熟練、規(guī)范，并且指定專人操作；

（4）對(duì)試驗(yàn)過程中的質(zhì)量控制控制點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)控，密切注意操作人員的加樣量、試劑使用、水浴箱中水溫及水位、孵育時(shí)間、洗板效果以及實(shí)驗(yàn)室溫濕度的變化等；

（5）性能驗(yàn)證過程使用同一批號(hào)的試劑盒，且使用質(zhì)控品進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控控制；

（6）試劑盒、質(zhì)控品室溫避光充分復(fù)溫、復(fù)融。

（7）試驗(yàn)后的數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計(jì)及得出合理結(jié)論等。

綜上所述，通過對(duì)北京萬泰HIV酶聯(lián)免疫試劑盒陰陽符合率、精密度（包括重復(fù)性和中間精密度）、檢出限驗(yàn)證表明，該試劑能夠滿足本實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量目標(biāo)，可用于本實(shí)驗(yàn)室HIV抗體初篩檢測(cè)。