大豆種皮膳食纖維的生物發(fā)酵與酶解法制備及其體外降脂的研究*

吳星會(huì)，丁文文，顏詩(shī)昱，蔡文琪，李 麗，滕文靜，王馨瑩，楊立娜*，劉 賀*

(渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013)

膳食纖維（Dietary Fiber，DF）是一類不易被人體消化酶所消化的高分子糖類，主要包括纖維素、果膠質(zhì)、木聚糖、甘露糖等[1]，根據(jù)其品質(zhì)特性可將其分為可溶性膳食纖維（Soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纖維（Insoluble dietary fiber，IDF）。DF 能夠改善人體營(yíng)養(yǎng)狀況，調(diào)節(jié)機(jī)體功能，具有平衡血糖、降低血脂、促進(jìn)減肥和預(yù)防癌癥等作用，是醫(yī)學(xué)界及營(yíng)養(yǎng)學(xué)界公認(rèn)的“第七營(yíng)養(yǎng)素”[2]。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，膳食結(jié)構(gòu)過(guò)于精細(xì)化的結(jié)果也逐漸導(dǎo)致了肥胖、高血壓、糖尿病等一部分慢性非傳染性疾病的發(fā)生[3]。有大量實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)DF的攝入可以降低高血脂、減輕肝臟組織損傷等，并且其功效與食用劑量成正相關(guān)性[4-6]。

我國(guó)是名副其實(shí)的全球第一大豆消費(fèi)國(guó)，大豆深加工產(chǎn)生的副產(chǎn)物大豆種皮被當(dāng)作飼料或廢棄物處理，造成極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。然而大豆種皮中含有豐富的膳食纖維，是制備膳食纖維的良好原料。目前常用的大豆種皮膳食纖維的提取方法[7]主要有發(fā)酵法、酶法、化學(xué)法及膜分離法等。其中，發(fā)酵法是指選擇合適的菌種，利用菌種自身產(chǎn)生的淀粉酶、蛋白酶等酶系來(lái)水解原料中的淀粉、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，從而提取膳食纖維[8]。采用發(fā)酵法制備膳食纖維不僅能夠降低生產(chǎn)成本，而且在工業(yè)化的生產(chǎn)中容易實(shí)現(xiàn)，是一種既安全又高效、既經(jīng)濟(jì)又優(yōu)產(chǎn)的膳食纖維制備方法[9]。酶法是采用酶制劑對(duì)原料進(jìn)行酶解，以除去表面雜質(zhì)得到不溶性膳食纖維粗品，再進(jìn)一步酶解改性，獲得水溶性膳食纖維的方法[10]。酶法提取膳食纖維的優(yōu)點(diǎn)之一是提取的膳食纖維具有高純度，它適用于蛋白質(zhì)和淀粉含量較高的原料。酶法應(yīng)用成本相對(duì)較高，但作用條件溫和，水解專一性強(qiáng)，能最大限度回收有效成分，且獲得的產(chǎn)品品質(zhì)好，對(duì)環(huán)境無(wú)污染[11]。

本研究采用發(fā)酵法和復(fù)合酶法提取大豆種皮膳食纖維，對(duì)比、分析兩種方法提取的大豆種皮膳食纖維的持水力、溶脹力、持油力等理化性質(zhì)差異，并且通過(guò)測(cè)定其對(duì)體外吸附膽固醇能力及體外結(jié)合膽酸鈉的能力，以此確定大豆種皮膳食纖維的降血脂能力，為大豆種皮膳食纖維的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)增加大豆種皮的經(jīng)濟(jì)效益，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與現(xiàn)實(shí)研究意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆種皮購(gòu)于錦州大豆皮經(jīng)銷(xiāo)公司；米曲霉購(gòu)于北京川秀科技有限公司；雞蛋購(gòu)于萬(wàn)達(dá)超市。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、α-淀粉酶、胰蛋白酶、糖化酶、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙醚、95%乙醇、硫酸、標(biāo)準(zhǔn)膽固醇、牛磺膽酸鈉、濃硫酸、冰乙酸及鄰苯二甲醛等試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AR124CN電子分析天平，奧豪斯OHAUS公司；JB-2A磁力攪拌器，上海雷磁創(chuàng)益儀表有限公司；UV2550紫外分光光度計(jì)，日本SHIMADZU公司；ZLWY-100B臺(tái)式恒溫振蕩器，上海一恒儀器有限公司；TDL-4OB離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與菌懸液制備

將米曲霉菌種接種到PDA平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4～5 d，采用平板劃線的方法擴(kuò)大培養(yǎng)2～3次。在米曲霉培養(yǎng)皿中加入2 mL無(wú)菌水，收集米曲霉孢子并計(jì)數(shù)，當(dāng)數(shù)量達(dá)到106～107個(gè)/mL時(shí)備用。

1.3.2 大豆種皮膳食纖維的制備

（1）復(fù)合酶解法制備大豆種皮膳食纖維。將大豆種皮粉碎，過(guò)80目篩，獲得大豆皮粗粉。在室溫下稱取200 g粗粉于通風(fēng)柜中加入乙醇，立即密封，防止其揮發(fā)。靜置1 h后，除去粗粉中的脂類物質(zhì)。接著向其中添加 10 mL PBS（緩沖液）（pH=6.0），隨后加入0.8 g α-淀粉酶，60°C下水浴 1 h。 冷卻 10 min至室溫后，加入0.16 g的胰蛋白酶，于60°C下水浴1 h。冷卻10 min至室溫后，加入0.8 g糖化酶，于60°C下水浴1 h，邊加熱邊攪拌。冷卻至室溫，真空抽濾得到濾液和濾渣。將濾渣用95%的無(wú)水乙醇漂洗3次，70℃恒溫干燥處理，將干燥后的濾渣粉碎后，過(guò)60目篩，得IDF。加入4倍體積的95%乙醇與濃縮后的濾液混合24 h進(jìn)行沉淀，離心過(guò)濾后得到濾渣，70℃條件下，恒溫干燥至恒重，將得到的干燥后的濾渣粉碎，過(guò)60目篩，即制得SDF。

（2）發(fā)酵法制備大豆種皮膳食纖維。準(zhǔn)確稱取20 g大豆種皮粗粉，放入容量為100 mL的錐形瓶中，按照料液比為1:4，加入蒸餾水，混合均勻，120℃滅菌15 min后，加入制備好的米曲霉孢子懸液，在37℃恒溫培養(yǎng)4～5 d，發(fā)酵至呈凝乳狀態(tài)，能聞到輕微的酸味。蒸餾水清洗發(fā)酵好的豆皮粗粉1～2次，真空抽濾得到濾液和濾渣。濾渣用95%的無(wú)水乙醇漂洗3次，進(jìn)行70℃恒溫干燥處理，將干燥后的濾渣粉碎后，過(guò)60目篩，得IDF。準(zhǔn)備上述濾液4倍體積的95%乙醇溶液與濾液混合24 h進(jìn)行沉淀，過(guò)濾后得到濾渣，70℃條件下，恒溫干燥至恒重，將得到的干燥后的濾渣粉碎，過(guò)60目篩，即制得SDF。

1.4 持水力的測(cè)定

在燒杯中，準(zhǔn)確稱取m1g已經(jīng)完全干燥的樣品，在燒杯中加入20℃的蒸餾水，混合后讓其充分浸泡1 h，使用濾紙將其濾干后所剩的樣品轉(zhuǎn)移至質(zhì)量為m2g的表面皿上，稱重，記為m3g，持水力用公式（1.1）計(jì)算。

1.5 溶脹力的測(cè)定

稱取質(zhì)量為m的樣品，放置在10 mL大小的量筒中，記錄此時(shí)在量筒內(nèi)的體積為V1，在量筒中加入適量蒸餾水，震蕩均勻，室溫條件下靜置24 h，記錄此時(shí)量筒內(nèi)的體積為V2，溶脹力利用公式（2）進(jìn)行計(jì)算。

1.6 持油力的測(cè)定

稱取樣品1.00 g，將其倒入15 mL的離心容器中，再將10 mL的大豆油加入離心容器中，充分搖勻混合，靜置1 h，于37℃環(huán)境下，以5 000 r/min的速度離心10 min，除去上層大豆油，稱量剩余殘留物質(zhì)量，根據(jù)公式（3）計(jì)算持油力。

1.7 體外膽酸鹽結(jié)合能力的測(cè)定

分別取 0.2 g、0.4 g、0.6 g、0.8 g、1.0 g 膳食纖維粉末于試管中，加入蒸餾水加至10 mL。在37°C恒溫振蕩器中振蕩2 h，向每個(gè)樣品中加入4 mL?；悄懰徕c（2%），在37°C的恒溫振蕩器中振蕩2 h。將搖勻后的混合物轉(zhuǎn)移到離心管中，4 000 r/min離心20 min，取上清液，計(jì)算膽酸鹽結(jié)合率，公式如（4）。

式中：X為膽酸鹽結(jié)合率，%；C1為實(shí)驗(yàn)組未結(jié)合的膽酸鹽質(zhì)量濃度，mol/L；1-C1為已結(jié)合的膽酸鹽質(zhì)量濃度，mol/L；C2為空白對(duì)照組總的膽酸鹽質(zhì)量濃度，mol/L。

1.8 體外吸附膽固醇的測(cè)定

1.8.1 膽固醇吸附隨時(shí)間的變化

新鮮雞蛋保留蛋黃部分，加入9倍量的蒸餾水，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚧虺嗜橐籂?，將上述蛋液加?00 mL錐形瓶中，并加入2 g的膳食纖維粉，調(diào)節(jié)pH 7.0，放入震蕩器內(nèi)，于37℃恒溫震蕩，分別取出30 min，60 min，90 min，120 min 的溶液，4 000 r/min離心20 min，取上清0.04 mL，在550 nm下采用鄰苯二甲醛法比色測(cè)定膽固醇含量。膽固醇的吸附量利用公式（5）計(jì)算。

1.8.2 膽固醇吸附隨pH變化

新鮮雞蛋保留蛋黃部分，加入9倍量的蒸餾水，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚧虺嗜橐籂?，將上述蛋液加?00 mL錐形瓶中，加入2 g的膳食纖維粉（上述樣品各做一份），并分別調(diào)節(jié)pH 2.0和7.0，放入震蕩器內(nèi)，于37℃恒溫震蕩2 h，4 000 r/min離心20 min，取上清0.04 mL，在550 nm下采用鄰苯二甲醛法比色測(cè)定膽固醇含量。膽固醇的吸附量利用公式（5）計(jì)算。

1.9 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)做3次，以表格記錄數(shù)據(jù)，相關(guān)數(shù)據(jù)處理采用Excel 2016并繪制圖表。通過(guò)SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p＜0.05表示數(shù)據(jù)有效并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 膳食纖維含量

由圖1可知，發(fā)酵法制備的SDF提取率為9.18%，IDF的提取率為86.31%。酶解法的SDF的提取率為12.24%，IDF的提取率為72.18%。結(jié)果表明，大豆種皮中的膳食纖維以IDF為主，酶解法提取的SDF含量顯著高于發(fā)酵法（p＜0.05）,而發(fā)酵法提取的IDF含量顯著高于酶解法（p＜0.05），造成這一現(xiàn)象的主要原因可能是在酶解過(guò)程中，隨著酶添加量的增加，酶促反應(yīng)速度也增加，使IDF發(fā)生降解，溶解度發(fā)生改變，一部分IDF變成SDF，從而使SDF提取率增加[12]。梁志宏等[7]以殘次裂棗為原料,分別采用化學(xué)法、酶解法和發(fā)酵法制備紅棗膳食纖維，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SDF得率最高的是酶解法，IDF得率最高的是發(fā)酵法。這與本次研究結(jié)論一致。

圖1 不同工藝膳食纖維的提取率

2.2 膳食纖維持水力、溶脹力和持油力

持水力與溶脹力是衡量膳食纖維品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)，值越大表示分子比表面積越大，結(jié)合水的能力越高，吸附性越強(qiáng)，生理活性越好[7]。持油力體現(xiàn)了膳食纖維降低血液中膽固醇的能力。如圖2所示，不同提取方式對(duì)SDF和IDF的理化性質(zhì)影響較大,通過(guò)比較可以看出,采用發(fā)酵法提取的SDF的理化性質(zhì)最佳。這可能是由于發(fā)酵過(guò)程中,米曲霉產(chǎn)生纖維素酶使原來(lái)聚合度高的SDF部分降解成結(jié)構(gòu)松散的小顆粒水溶性膳食纖維，從而增加了水與膳食纖維的接觸面積，提高了持水力和溶脹力。有研究表明[13]，膳食纖維的持水力和持油力與樣品粒度有關(guān)。樣品粒度減小，使得可供吸水或吸油的表面積增大，且細(xì)顆粒樣品的纖維組成結(jié)構(gòu)更為松散，毛細(xì)孔更多，能吸附更多的水和油。

圖2 不同提取工藝大豆種皮膳食纖維的持水力、溶脹力和持油力

不僅如此，兩種方法處理的SDF在持水力、溶脹力和持油力方面也都顯著高于IDF，這可能是由于發(fā)酵法和酶解法生產(chǎn)過(guò)程溫和，得到的SDF具有更好的疏松多孔結(jié)構(gòu)，使水和油更容易包裹其中[7]。并且大豆種子在破碎過(guò)程中纖維聚合物的斷裂，也可能導(dǎo)致樣品SDF和其他組分相比，聚合度降低，吸水力增強(qiáng)。除此之外，已有研究表明SDF在水溶液中可形成凝膠，自身吸收水分的同時(shí)產(chǎn)生的膠狀物也可防止水分流失[14]。

2.3 膳食纖維的膽酸鹽結(jié)合能力

膽固醇的合成與代謝都與膽汁酸的肝臟循環(huán)密切相關(guān)。DF對(duì)膽汁酸的吸收可以阻礙腸道中膽汁酸的重復(fù)吸收，進(jìn)一步加速膽固醇分解，降低血清膽固醇含量[15]。如圖3所示，隨著大豆膳食纖維含量的增加，各組樣品與膽酸鈉的結(jié)合率均呈上升趨勢(shì)，且發(fā)酵法制備的SDF結(jié)合膽酸鈉的能力最為出色。在加入大豆種皮膳食纖維0.8～1.0 g時(shí)，大豆種皮膳食纖維結(jié)合的膽酸鹽基本達(dá)到飽和，此時(shí)發(fā)酵法制備SDF對(duì)膽酸鈉的結(jié)合率為70.28%。酶解法制備的膳食纖維中，SDF的膽酸鈉結(jié)合能力同樣高于IDF。產(chǎn)生這種結(jié)論的主要原因可能是源于SDF和IDF在結(jié)構(gòu)上的差異。張瑜等[16]對(duì)不同工藝制備的刺梨果渣膳食纖維進(jìn)行電鏡掃描，發(fā)現(xiàn)酶法IDF呈不規(guī)則多孔的塊狀結(jié)構(gòu),發(fā)酵法IDF呈小顆粒狀結(jié)構(gòu);而這兩種方法制備的SDF超微結(jié)構(gòu)均呈疏松蜂窩狀結(jié)構(gòu)。周麗媛等[17]對(duì)黑小麥麩皮可溶性膳食纖維進(jìn)行改性研究，發(fā)現(xiàn)超微提取的SDF持水、持油和溶脹性明顯低于超高壓和擠壓膨化，說(shuō)明SDF的疏松網(wǎng)格結(jié)構(gòu)對(duì)膽酸鹽的結(jié)合更為有利。另外，有研究表明SDF中的活性基團(tuán)可以螯合吸附膽汁酸之類的有機(jī)分子[18-19]，有利于SDF更好地發(fā)揮生理作用。

圖3 不同用量膳食纖維的膽酸鈉結(jié)合率

2.4 測(cè)定膽固醇吸附能力的結(jié)果

已知高膽固醇可以誘發(fā)心血管疾病，DF可以阻止膽固醇吸收。圖4表示的是膽固醇吸附量與吸附時(shí)間的關(guān)系。圖5表示膽固醇吸附量與pH關(guān)系。如圖4中，在0～90 min時(shí)，各組分的膽固醇吸附量均隨吸附時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，且發(fā)酵制備的SDF吸附能力最好。90～150 min時(shí)，膳食纖維達(dá)到吸附平衡。在不同的提取方法下，同一吸附時(shí)間時(shí)，SDF吸附膽固醇的能力均高于IDF。

圖4 膽固醇吸附量與吸附時(shí)間的關(guān)系

圖5 膽固醇吸附量與pH值的關(guān)系

此外，pH值對(duì)膳食纖維膽固醇吸附效果影響顯著。由圖5可知，pH=7時(shí)的膽固醇吸附效果明顯高于pH=2時(shí)的膽固醇吸附效果，且兩種pH條件下SDF對(duì)膽固醇的吸附量均高于IDF。這可能是由于pH值為2.0的環(huán)境內(nèi)有較多的氫離子存在，使得膽固醇和SDF帶了較多正電荷，彼此存在互斥的力，導(dǎo)致結(jié)合能力減弱，從而降低了吸附量[20]。張瑜等[16]對(duì)發(fā)酵法、酶解法和化學(xué)法制備的刺梨果渣膳食纖維膽固醇吸附力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)3種處理方法得到的DF對(duì)膽固醇吸附力在pH 7.0時(shí)明顯高于在pH 2.0時(shí)，與本次研究結(jié)論一致。

3 結(jié)論

采用發(fā)酵法提取的大豆種皮中含有9.18%SDF和86.31%IDF，并且SDF的持水力、膨脹力以及持油力均高于IDF。膳食纖維在中性條件下高于酸性條件下對(duì)膽固醇的吸附作用。DF對(duì)膽酸鹽的吸附趨勢(shì)先加快后趨于平衡，當(dāng)DF的添加量為1 g時(shí)，SDF（發(fā)酵法）對(duì)膽酸鹽的結(jié)合率達(dá)到最大70.28%，IDF（發(fā)酵法）對(duì)膽酸鹽的結(jié)合率達(dá)到最大50.13%。在0～90 min時(shí)，DF的膽固醇吸附量均隨吸附時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)；DF在中性條件下高于酸性條件下對(duì)膽固醇的吸附作用，且SDF＞IDF。

采用復(fù)合酶法提取的大豆種皮中含有9.24%SDF，62.18%IDF，且SDF的持水力、膨脹力以及持油力均以微小差距高于IDF。膽汁酸結(jié)合能力與膽固醇吸附能力與發(fā)酵法表現(xiàn)類似，但是效果遠(yuǎn)不及發(fā)酵法。