溪黃草藥材質量標準研究?

馬鵬文，師慶媛，朱昱瀾，任一杰，2△

1 甘肅省中藥固體分散制劑重點實驗室/甘肅隴神戎發(fā)藥業(yè)股份有限公司，甘肅 蘭州730102；2 甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室

溪黃草在南方各地應用普遍，具有清熱利濕、退黃、涼血散瘀的功效，可用于治療濕熱黃疽、濕熱瀉痢、癮閉、跌打疲腫等疾?。?］。隨著中藥發(fā)展及中成藥生產規(guī)模的不斷擴大，溪黃草的應用也越來越廣泛。消炎利膽片、膽石通膠囊中均以溪黃草作為主要原料，但《中華人民共和國藥典》2015年版一部藥材項下未收載溪黃草藥材品種［2］，現(xiàn)行質量檢驗標準均為地方標準［3-4］。各地方標準中溪黃草的質量控制標準均未制定定性指標和含量測定指標。為此，本研究采用薄層色譜法檢測溪黃草中迷迭香酸成分，采用HPLC法測定齊墩果酸、熊果酸含量，以期為溪黃草藥材質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器AX204 萬分之一電子天平（上海梅特勒公司）；MS205DU 十萬分之一電子天平（上海梅特勒公司）；HH-6 數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；SB25-12DTD 數控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TU1901 紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；Waters 152高效液相色譜儀（美國Waters公司）。

1.2 試劑迷迭香酸對照品（批號：111871-201706）、齊墩果酸對照品（批號：110709-201607）、熊果酸對照品（批號：110742-201622）均購于中國食品藥品檢定研究院。銀龍牌硅膠G 薄層板（煙臺市化學工業(yè)研究所）；甲醇、乙腈、乙酸銨為色譜純，水為哇哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。本實驗中10 批溪黃草藥材為單位藥材供應商提供，產地分別為安徽、廣東、廣西、河南，依次編號1～10。

2 方法與結果

2.1 迷迭香酸薄層鑒別取溪黃草藥材粉末2.0 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 min（功率500 W，頻率40 kHz），濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取迷迭香酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法試驗，吸取對照品溶液與供試品溶液各2μL，甲醇作為空白溶液，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2∶3∶4∶0.5∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下檢視，供試品色譜中在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點，空白無干擾。因該方法操作簡便、快速，斑點顯色清晰，確認該方法可用于溪黃草藥材中迷迭香酸的定性鑒別。薄層色譜圖見圖1。

圖1 溪黃草藥材中迷迭香酸薄層鑒別

2.2 齊墩果酸、熊果酸含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK C18MGⅡ，以十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑；流動相：乙腈-甲醇-0.5%乙酸銨（67∶12∶21），等度洗脫；流速：1 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。

2.2.2 對照品溶液 取齊墩果酸及熊果酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含齊墩果酸80μg，熊果酸0.2 mg的混合溶液，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液 取溪黃草藥材粉末2.0 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，用甲醇補足減失的重量，微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 空白對照溶液 取提取溶劑甲醇作為陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗 取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液各20μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，齊墩果酸與熊果酸的分離度為1.59，理論板數以熊果酸計為7355，齊墩果酸與熊果酸保留時間分別為21.670 min和22.720 min。結果表明該方法專屬性好，其他成分對測定無干擾。見圖2—4。

圖2 齊墩果酸、熊果酸混合對照品

2.2.6 線性關系考察 精密移取“2.2.1”項下齊墩果酸、熊果酸混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于10 mL 容量瓶中，定容，分別進樣20μL，以峰面積值（Y）對進樣量（X）進行線性回歸，得標準曲線方程：齊墩果酸回歸方程為：Y=1.09×104X-11 300，r＝0.9998，線性范圍：5.066-50.664 2μg/mL；熊果酸回歸方程為：Y=6.9×103X-8660，r=0.9998，線性范圍：9.735-97.352μg/mL。結果表明線性關系良好。

2.2.7 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果齊墩果酸峰面積RSD=0.7%，熊果酸峰面積RSD=0.6%。儀器精密度良好。

圖3 空白溶劑色譜圖

圖4 溪黃草樣品HPLC色譜圖

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液20μL，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h 時測定，記錄峰面積。結果齊墩果酸峰面積的RSD=0.9%，熊果酸峰面積的RSD=0.5%，表明供試品溶液在室溫下24 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復性試驗 取1號樣品適量，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法平行制備6 份供試品溶液，計算齊墩果酸含量為0.749 mg/g，RSD=1.2%，熊果酸含量為1.503 mg/g，RSD=0.9%，表明本方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取已知齊墩果酸含量（齊墩果酸含量為777.197μg/g）的溪黃草樣品9份，每份約0.5g，精密稱定，分別精密加入對照品溶液（齊墩果酸對照品382.389 μL/mL）0.8、1.0、1.2 mL 至50 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，記錄峰面積并計算齊墩果酸的加樣回收率。取已知熊果酸含量（熊果酸含量為1.754 mg/g）的溪黃草樣品9 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入對照品溶液（熊果酸對照品0.786 mg/mL）0.8、1.0、1.2 至50 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，記錄峰面積并計算熊果酸的加樣回收率。見表1—2。

表1 齊墩果酸的加樣回收率（n=9）

表2 熊果酸的加樣回收率（n=9）

2.2.11 樣品含量測定 選取10 個批次的溪黃草樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，記錄峰面積并計算齊墩果酸和熊果酸的含量（按干燥品計），結果見表3。

表3 齊墩果酸與熊果酸含量測定結果 mg/g

3 討論

溪黃草中含有齊墩果酸和熊果酸，其中熊果酸具有體外抗乙肝病毒的作用［5-6］。近年來對溪黃草藥材中化學成分和質量標準的研究文獻［7-9］眾多，相關文獻［10-11］中分別檢測溪黃草中迷迭香酸、齊墩果酸及熊果酸含量，但不同品種間迷迭香酸含量差異較大，無法統(tǒng)一標準［12-13］；溪黃草藥材不同品種間齊墩果酸和熊果酸含量差異小于迷迭香酸，故選擇迷迭香酸為定性鑒別的檢查指標，齊墩果酸和熊果酸為含量控制指標。

TLC 實驗中分別選擇環(huán)乙烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲酸（15∶3∶3.5∶1）、正己烷-乙酸乙酯-甲酸（3∶3∶0.2）、甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2∶3∶4∶0.5∶2）為展開劑，對迷迭香酸的展開條件進行優(yōu)化，結果以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2∶3∶4∶0.5∶2）為展開劑時展開效果最好；另選用乙醇、70%乙醇、甲醇作為提取溶劑，結果以甲醇作為提取溶劑時展開效果最好。

根據資料［14-15］探索齊墩果酸、熊果酸含量的檢測條件。對樣品的提取條件進行優(yōu)化，包括提取方法、提取時間、溶劑選擇等，分別對比了甲醇超聲提取、回流提取、索氏提取45 min 的提取效果，結果超聲45 min提取的齊墩果酸、熊果酸含量最高；同時對比超聲15、30、45 min時的提取效果，結果超聲30 min 和超聲45 min 時齊墩果酸、熊果酸含量差異不大，故選擇超聲30 min；溶劑選擇考察了70%甲醇、甲醇、70%乙醇、乙醇的提取效果，結果用甲醇提取時效率最高。