HPLC 法測(cè)定抗毒合劑中葛根素的含量?

杜云鋒，杜向紅△，張 偉，劉 偉，陳 寧

1 河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州450008；2 河南中醫(yī)藥大學(xué)分析測(cè)試中心

中藥抗毒合劑是河南省人民醫(yī)院院內(nèi)制劑（豫藥制字Z04010258），由金銀花、連翹、葛根、大青葉、板藍(lán)根和柴胡6 味中藥組成。該方為本院著名兒科專家羅致桓主任的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有清熱解毒和涼血消腫的功效，主治上呼吸道感染及感冒發(fā)熱、扁桃體炎、腮腺炎等［1］。其中葛根具有解肌退熱、透發(fā)麻疹、生津止渴、升陽(yáng)止瀉的作用，葛根素是葛根的主要活性成分之一［2-6］，為更好地控制藥品質(zhì)量，本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［7-10］，采用高效液相色譜法測(cè)定其含量，以期為全面有效控制產(chǎn)品質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)［11-13］。

1 材料

1.1 儀器Agilent 1260 高效液相色譜儀（四元梯度泵、DAD 檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；METTLER AE240 十萬(wàn)分之一天平、FA2004A 萬(wàn)分之一天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S 型水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠）；1810-B 型石英自動(dòng)雙重純水蒸餾器（江蘇大地儀器廠）；ZF-7 型三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；DHG-9053A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠）；HP8200 型飛利浦電吹風(fēng)（珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)飛利浦家適電器有限公司）。

1.2 藥品與試劑葛根素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111224）；甲醇為色譜純；娃哈哈純凈水；其他試劑為分析純?？苟竞蟿ㄅ?hào)：20130110、20130125、20130212）由河南省人民醫(yī)院提供。所用飲片均購(gòu)于禹州藥材市場(chǎng)，并經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠(chéng)明教授鑒定。本實(shí)驗(yàn)所有樣品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)均為《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Agilent C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）柱；流動(dòng)相：甲醇-水溶液（23∶77）；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算不低于4000，且分離度大于1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 取葛根素對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 mL 容量瓶中，加30%乙醇制成每1 mL含20μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 精密量取抗毒合劑1 mL，置于10 mL 容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻備用。

2.2.3 陰性溶液制備 按處方配比，取除去葛根的其他藥材，按抗毒合劑制法制成合劑，再按供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10μL，注入液相色譜儀中，陰性對(duì)照樣品在葛根素相應(yīng)保留時(shí)間無(wú)色譜峰干擾。見圖1—3。

圖1 葛根素對(duì)照品溶液色譜圖

圖2 抗毒合劑供試品溶液色譜圖

圖3 抗毒合劑陰性對(duì)照品色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下葛根素對(duì)照品溶液，分別以4、8、10、15、25 μL 按“2.1”色譜條件進(jìn)樣，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=138.63X-58.954（r=0.9998），表明葛根素在10～62.5μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖4。

圖4 葛根素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，以葛根素峰面積計(jì)算，RSD為0.19%，表明儀器精密度良好，見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)供試品6 份（批號(hào)：20130110），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取各供試品溶液10μL，以葛根素峰面積計(jì)算，RSD 為1.10%，表明本試驗(yàn)方法重復(fù)性良好，見表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取相同供試品溶液，分別于配制后0、4、8、12、24 h，精密吸取10 μL，測(cè)定，結(jié)果葛根素峰面積RSD 為2.04%，表明制備溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一樣品2.5 mL（批號(hào)：20130110），用30%乙醇定容至50 mL，精密量取6份，分別加入一定量的葛根素對(duì)照品溶液，制備樣品溶液，精密吸取10μL，注入液相色譜儀，按“2.1”色譜條件測(cè)定。結(jié)果見表4。

表4 葛根素回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5 含量測(cè)定取3 個(gè)不同批次樣品，精密量取，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試樣品溶液，分別精密吸取樣品溶液各10μL，按“2.1”色譜條件測(cè)定，根據(jù)回歸方程計(jì)算含量。結(jié)果見表5。

表5 含量測(cè)定結(jié)果 mg/mL

3 討論

抗毒合劑以金銀花、連翹為君藥，其中金銀花［14］宣散風(fēng)熱，清解血毒，具有廣譜抗菌、抗病毒、解熱抗炎、利膽保肝、降脂等作用；連翹［15］散結(jié)消腫，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用，兩者共奏清熱解毒，涼血消腫功效。葛根、大青葉、板藍(lán)根、柴胡為臣藥，其中葛根［16］解肌退熱、發(fā)表透疹；大青葉［17］解毒、涼血、止血，具有抗病原微生物、抗內(nèi)毒素、抗炎、增強(qiáng)免疫功能等作用；板藍(lán)根［18］涼血消斑、利咽止痛，具有清熱解毒、涼血利咽等作用；柴胡解表退熱、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣。諸藥聯(lián)用主治上呼吸道感染及感冒發(fā)熱、扁桃體炎、腮腺炎等。已應(yīng)用于臨床數(shù)十年，療效顯著。葛根素為葛根發(fā)揮功效的主要指標(biāo)性成分，具有解肌退熱、透發(fā)麻疹、生津止渴、升陽(yáng)止瀉等作用［19］。

目前對(duì)該制劑的研究主要集中在提取工藝和藥理作用2 方面。王豫等［20］對(duì)金銀花、葛根藥材進(jìn)行了提取工藝研究；劉宜生［21］對(duì)抗毒合劑進(jìn)行了急性毒性實(shí)驗(yàn)研究。對(duì)其質(zhì)量控制方法按照醫(yī)院內(nèi)部制劑手冊(cè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，僅局限于對(duì)其中單一成分綠原酸的薄層鑒別，而無(wú)明確的含量測(cè)定方法。高效液相色譜法能夠較好反映中藥整體質(zhì)量，具有分離效能高、檢測(cè)靈敏度高、分析速度快、選擇性高等特點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于中藥及其制劑的綜合宏觀分析［22］。

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙醇不同濃度對(duì)樣品進(jìn)行溶解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30%乙醇作為葛根素溶媒時(shí)分離度好，峰形對(duì)稱，無(wú)雜峰干擾，因此葛根素含量測(cè)定時(shí)采用30%乙醇作為溶劑。中藥制劑成分復(fù)雜，各藥味之間成分相互干擾，葛根素最大吸收波長(zhǎng)為250 nm，但在其檢測(cè)波長(zhǎng)下含量測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)峰形拖尾且與相鄰峰有干擾，進(jìn)而對(duì)流動(dòng)相梯度進(jìn)行了探索，結(jié)果以被測(cè)成分峰對(duì)稱性好且分離效果較佳的梯度為最佳梯度。同時(shí)分別比較了乙腈-水、甲醇-水以及甲醇-水溶液（23∶77）作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)以甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)色譜峰分離度差，且相同成分出峰時(shí)間較長(zhǎng)，基線較漂；以乙腈-水作為流動(dòng)相出峰時(shí)間縮短，但是基線較漂，且色譜峰有拖尾現(xiàn)象；以甲醇-水溶液（23∶77）作為洗脫溶劑時(shí)供試品峰基線較平穩(wěn)，各色譜峰的分離效果較好，因此采用甲醇-水溶液（23∶77）為流動(dòng)相。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法便于操作、分離效果好，專屬性好，重現(xiàn)性好，可作為抗毒合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的含量測(cè)定方法。