黑小米中角鯊烯的提取與測(cè)定

王克輝，袁彩霞，王璐，何海寧，李蕊岑，洪霞

1.甘肅中商食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司（蘭州 730010）；2.甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司（蘭州 730010）

角鯊烯為無(wú)色或微黃色透明油狀液體，具有令人愉快的氣味，吸氧變黏，成亞麻油狀液體[1-2]。角鯊烯早先在日本作為治療疾病的藥物，如肺結(jié)核、腦膜結(jié)核、淋巴結(jié)核、骨結(jié)核疾病等[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，角鯊烯對(duì)抗疲勞、肺心病、防止慢性支氣管炎、改善心功能及調(diào)節(jié)體內(nèi)某些生化活動(dòng)等具有非常重要作用[5-6]。角鯊烯的活性較高、易氧化，使得很多人對(duì)長(zhǎng)期食用角鯊烯會(huì)不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用產(chǎn)生疑問(wèn)[7-8]。為此，饒麗晶等[9]對(duì)角鯊烯進(jìn)行了白鼠亞急性毒性研究，試驗(yàn)劑量以成人日攝入量的100倍為最高劑量，對(duì)整個(gè)試驗(yàn)組動(dòng)物灌喂30 d后發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物體重?zé)o較大變化，肝臟等臟器系數(shù)、食物利用率和試驗(yàn)組類似血常規(guī)、血生化指標(biāo)與對(duì)照組有顯著差異，但均在正常范圍之內(nèi)[9]。由此得出結(jié)論，角鯊烯對(duì)機(jī)體沒(méi)有毒副作用及不良影響，可以作為保健食品開(kāi)發(fā)[10]。

不同產(chǎn)品中角鯊烯的提取與分離方法不同，常見(jiàn)的角鯊烯提取與分離的方法主要包括皂化分離法[11]、柱色譜分離法[12]、分子蒸餾法[13]、超臨界提取法[14]、吸附分離法[15]、溶劑萃取法[16]等。其中最常用的是皂化分離法和分子蒸餾法。皂化分離法一次性去除脂肪酯和甘油酯效果明顯，使角鯊烯含量明顯提高，但此方法操作過(guò)程復(fù)雜，反應(yīng)過(guò)程需大量低級(jí)醇，且在堿性條件下進(jìn)行，對(duì)目的產(chǎn)物破壞性大[17-18]。分析蒸餾法特別適用于實(shí)驗(yàn)室分離，也易于工業(yè)化，利用該方法存在的缺點(diǎn)是成本較高，且對(duì)于原料中目的產(chǎn)物含量較低，提取效果不明顯，需經(jīng)預(yù)處理原料中的組分在超臨界二氧化碳中溶解度較大，故分離效果不高，并且投資較大，操作費(fèi)用較大[19-20]。

試驗(yàn)首次采用水解法提取黑小米中的油酯，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀法確定油酯中的主要成分，確定小黑米油酯中含有角鯊烯。再將角鯊烯粗品通過(guò)硅膠柱色譜法進(jìn)一步凈化分離純化，得到的角鯊烯通過(guò)氣相色譜法進(jìn)行定性分析研究。該方法操作過(guò)程簡(jiǎn)單，經(jīng)硅膠柱凈化分離后的角鯊烯與其他雜質(zhì)峰得到很好的分離，消除了基質(zhì)干擾，產(chǎn)品純度高。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院，99.8%）；石油醚（30～60 ℃，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，99.3%）；乙醚（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，99.3%）；丙酮（分析純，99.6%，西安市永紅化工原料公司）；正己烷（色譜純，99.6%，西安市永紅化工原料公司）；黑小米樣品（來(lái)自蘭州市華聯(lián)超市同批生產(chǎn)的小黑米）；二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

XS 225A-SCS電子天平（安徽首衡稱重科技有限公司）；GENIUS3渦旋振蕩儀（無(wú)錫沃信科技有限公司）；移液管；吸耳球；CF16RXⅡ臺(tái)式高速離心機(jī)（鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；SB-100B超聲波清洗機(jī)（無(wú)錫沃信科技有限公司）；氣相色譜儀（帶有氫火焰離子化檢測(cè)器，Agilent 7890B）；硅膠柱（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，為帶活塞的砂芯玻璃層析柱（10 mm×250 mm），加3.0 g硅膠，頂端加0.5 cm無(wú)水硫酸鈉）；恒溫水浴鍋（無(wú)錫沃信科技有限公司）；渦旋振蕩器（無(wú)錫沃信科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑小米中油酯的提取

試驗(yàn)利用水解法提取黑小米中的油脂，通過(guò)氣相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用儀法測(cè)定油酯組分的主要成分。

1.3.1.1 水解

稱取2.0 g（精確至0.1 mg）均勻的樣品置于100 mL具塞試管中，加入5 mL 95%乙醇和10 mL超重水，混勻，加入20 mL鹽酸溶液，混勻。將試管放入70～80℃水浴中，水解50 min。每隔10 min振蕩一下試管，確保在試管壁上的顆粒物混入溶液中。水解完成后，取出試管冷卻至室溫。

1.3.1.2 提取

水解后的樣品，加入20 mL 95%乙醇，混勻，然后加入50 mL乙醚-石油醚混合溶液（1∶1，V/V），振搖5 min，靜置10 min。用少量的乙醚-石油醚混合溶液沖洗具塞試管和塞子，將有機(jī)層轉(zhuǎn)移到250 mL燒杯中。按照以上步驟重復(fù)提取水解液2次，將3次收集的有機(jī)層合并到250 mL燒杯中。放置于水浴鍋上蒸發(fā)至干，得到樣品提取物。

1.3.1.3 凈化與分離

將上述樣品提取液轉(zhuǎn)移至50 mL小燒杯中，加入5 mL石油醚，混勻，倒入用石油醚活化后的硅膠柱中，然后重復(fù)2次用5 mL石油醚潤(rùn)洗燒杯，洗滌液一并倒入硅膠柱中，當(dāng)石油醚液面與上端無(wú)水硫酸鈉層相切時(shí)，加入20 mL石油醚，收集全部的35 mL洗脫液置于50 mL收集管中，用氮吹儀氮吹至干，隨后用正己烷定容至1.0 mL，充分振搖，轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣小瓶，待測(cè)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取50 mg角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，搖勻，得到1.0 mg/mL角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.3 氣相色譜法測(cè)定條件

色譜條件：檢測(cè)器FID（氫火焰離子化檢測(cè)器）；色譜柱：HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；柱溫：125 ℃（1 min）→25 ℃/min→150 ℃（1 min）→8 ℃/min→240（6 min）；汽化溫度：220 ℃；檢測(cè)溫度：250 ℃；氮?dú)猓?.5 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解時(shí)間的優(yōu)化

試驗(yàn)考察了不同水解時(shí)間（10，20，30，40，50，60和70 min）對(duì)黑小米中角鯊烯提取含量的影響。如圖1所示，隨著水解時(shí)間的增大，角鯊烯的含量不斷的增大，且在50 min后角鯊烯的含量保持不變，因此，試驗(yàn)選擇50 min為最優(yōu)水解時(shí)間。

圖1 不同水解時(shí)間對(duì)黑小米中角鯊烯提取含量的影響

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

試驗(yàn)考察了不同溶劑（乙醚、石油醚、乙醚-石油醚2∶1、乙醚-石油醚1∶1、乙醚-石油醚1∶2，V/V）對(duì)黑小米中角鯊烯含量提取的影響，結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯觯萌軇┮颐?石油醚（1∶1，V/V）提取后測(cè)定的角鯊烯含量最高。

圖2 不同溶劑對(duì)黑小米中角鯊烯含量提取的影響

2.3 兩種不同提取法的比較

稱取6份樣品，分別采用水解法和索氏抽提法兩種方法對(duì)黑小米中油酯進(jìn)行提取，并對(duì)其提取含量進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示?？梢钥闯觯夥ㄌ崛〉挠椭扛哂谒魇铣樘岱ǖ?，這說(shuō)明小黑米中油酯主要是飽和烴類油脂[21-22]，因此試驗(yàn)選用水解法提取黑小米中油酯。

表1 水解法和索氏抽提法兩種方法比較 單位：g/kg

2.4 凈化效果

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，動(dòng)植物油中角鯊烯測(cè)定方法主要為氣相色譜法，其樣品前處理方法是非油脂類樣品（油脂類樣品直接皂化-甲酯化）經(jīng)水解，乙醚-石油醚混合液提取，皂化和甲酯化，正己烷萃取后直接進(jìn)樣的方法。由圖3可以看出，過(guò)多的雜質(zhì)峰對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物角鯊烯的峰形產(chǎn)生干擾，此外直接進(jìn)樣的方式會(huì)對(duì)色譜柱造成一定程度的污染。為了改善角鯊烯的峰形、減少對(duì)色譜柱等的污染、提高儀器檢測(cè)靈敏度，試驗(yàn)采用水解提法提取，硅膠柱凈化分離小黑米中角鯊烯。由圖4可見(jiàn)，經(jīng)硅膠柱凈化分離，角鯊烯獲得基線分離，消除雜質(zhì)峰干擾，大大提高了檢測(cè)靈敏度。

圖3 黑小米中角鯊烯凈化前色譜圖

圖4 黑小米中角鯊烯凈化后色譜圖

2.5 回收率和精密度

黑小米中角鯊烯含量較少，因此選擇它作為加標(biāo)回收試驗(yàn)的樣品。樣品的添加量分別為5.00，10.00和50.00 mg/kg，每一添加水平的樣品數(shù)為6個(gè)，樣品處理按1.3.1方法進(jìn)行。先測(cè)定樣品中角鯊烯的本底含量，再分別測(cè)定加標(biāo)樣品中角鯊烯的含量，扣除空白值后，計(jì)算加標(biāo)回收率，加標(biāo)樣品的回收率及精密度結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，平均添加回收率為91.8%～96.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）＜5.6%（n=6）。

表2 加標(biāo)樣品的回收率及精密度

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取適量1.0 mg/mL角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用正己烷配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，質(zhì)量濃度分別為0.20，1.00，5.00，10.00，25.00，50.00和100.00 μg/mL。按選定的氣相色譜條件，取1 μL進(jìn)樣，以峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，在上述濃度范圍內(nèi)呈良好線性，如圖5所示，回歸方程為Y=1.10704666X-0.1191426，線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.99992。

圖5 不同濃度角鯊烯線性關(guān)系圖

2.7 實(shí)際樣品分析

試驗(yàn)對(duì)常見(jiàn)的4種小米樣品中的角鯊烯含量進(jìn)行了分析，各樣品中角鯊烯含量見(jiàn)表3。由表可以看出，小黑米中的角鯊烯含量明顯高于其他小米，是植物性角鯊烯的良好來(lái)源。

表3 市售的6種不同品牌小米樣品角鯊烯含量的測(cè)定

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立水解法提取，硅膠柱凈化分離，氣相色譜測(cè)定小黑米中角鯊烯的方法。樣品提取后經(jīng)硅膠柱凈化分離，樣品回收率高、凈化效果好，減少了對(duì)色譜柱的污染，角鯊烯達(dá)到基線分離，避免了干擾組分對(duì)被測(cè)物峰的影響，大大提高了檢測(cè)靈敏度，較文獻(xiàn)方法靈敏、可靠，故該方法也可以用于其他實(shí)際樣品中角鯊烯的分析。