UPLC-MS/MS法測定番茄醬中5種鏈格孢霉毒素

王遠(yuǎn) ，邢麗杰 ，李先義，羅瑞峰，劉玉晗

1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院（石河子 832000）；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院（石河子 832000）

番茄醬是生活中必不可少的調(diào)味品之一，它能大大提高食品的美味。新疆是生產(chǎn)番茄醬的主要產(chǎn)地，產(chǎn)量占全國的90%以上，并且出口總量達(dá)100多萬 t。鏈格孢菌是一種廣泛分布在蔬菜上的腐生、內(nèi)生和致病性菌株，其在低溫、潮濕的環(huán)境下生長繁殖，是導(dǎo)致蔬菜腐爛變質(zhì)的主要微生物[1]。鏈格孢菌可產(chǎn)生70多種有毒代謝產(chǎn)物，統(tǒng)稱為鏈格孢霉毒素[2-3]，其具有細(xì)胞毒性、基因毒性以及急性毒性，會對人體健康產(chǎn)生危害[4-5]。Sanzani等[6]對意大利南部阿普利亞地區(qū)的新鮮和干燥番茄樣品進(jìn)行了鏈格孢毒素檢測，結(jié)果表明新鮮和干燥的番茄中均存在細(xì)交鏈格孢菌酮酸（tenuazonic acid，TEA），且干番茄受污染程度高于新鮮番茄。Puntscher等[7]對奧地利的番茄醬進(jìn)行檢測，結(jié)果表明番茄醬中含有鏈格孢酚（alternariol，AOH）、交鏈格孢酚單甲醚（alternariol monomethylether，AME）、細(xì)交鏈孢菌酮酸（TEA）和騰毒素（tentoxin，TEN）。目前從食物中檢出的鏈格孢菌毒素主要有騰毒素（TEN）、鏈格孢霉素（alternaria，ALT）、交鏈格孢酚單甲醚（AME）、鏈格孢酚（AOH）以及細(xì)交鏈格孢菌酮酸（TEA）。

我國尚未針對番茄醬建立鏈格孢霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)和檢測方法。現(xiàn)有文獻(xiàn)資料報道的鏈格孢霉毒素的定量方法主要有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、高效液相色譜法[9-10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]。其中氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法前處理需要進(jìn)行衍生化處理，過程復(fù)雜。高效液相色譜法分離速度快，但是抗干擾差，存在一定假陽性。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、穩(wěn)定性好等特點，成為復(fù)雜食品分析的主要方法。近年來QuEChERS前處理凈化技術(shù)以其快速、溶劑使用量少和操作簡單等特點被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜樣品的前處理[14-15]。試驗以番茄醬為基質(zhì)，研究QuEChERS方法中不同凈化劑的凈化效果，建立番茄醬中鏈格孢霉毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測定方法，為番茄醬中鏈格孢霉毒素的檢測提供技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲酸、乙腈、甲醇（HPLC純，德國CNW公司）；C18吸附劑、PSA吸附劑、GCB吸附劑、無水硫酸鎂、氯化鈉（德國CNW公司）；騰毒素（TEN）、鏈格孢霉素（ALT）、鏈格孢酚甲基乙醚（AME）、鏈格孢酚（AOH）、細(xì)交鏈格孢菌酮酸（TEA）5種ATs標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于99%，德國Dr公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters XEVO TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；Sigma 3-30k型離心機（德國Sigma公司）；MS3-basic型漩渦混合器（德國IKA公司）；N-EVAPTM112型氮吹儀（美國Organomation公司）；KQ-600DE型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器公司）；ULPHW-IV型超純水機（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.3 儀器參數(shù)

色譜條件：BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；流速為0.4 mL/min；梯度洗脫：0～0.5 min，95%（A）；0.51～5 min，95%～5%（A）；5.01 min，95%（A）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子和多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑氣流速為800 L/h，錐孔氣流速為50 L/h，氬氣作為碰撞氣。5種鏈格孢菌毒素在多反應(yīng)監(jiān)測模式下質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測離子對及質(zhì)譜條件

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取5.00 g番茄醬樣品于50 mL離心管中，向離心管中分別加入2 mL水和10 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取20 min；然后加入1 g NaCl充分振搖，使其NaCl完全溶解后（使水相與乙腈相分層），以10000 r/min高速離心5 min。準(zhǔn)確移取2 mL上清液于預(yù)先盛有0.5 g MgSO4和100 mg C18吸附劑的10 mL離心管中，渦旋混勻，在5000 r/min下離心3 min，取1 mL凈化液在40 ℃下氮吹干，用1 mL乙腈水（體積比，1+1）溶液定容，過0.22 μm有機濾膜，供UPLC-MS/MS分析。

1.5 線性范圍及檢出限

鏈格孢菌毒素單標(biāo)儲備液的配制：準(zhǔn)確稱取每種鏈格孢菌毒素的單個標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液（-20 ℃保存）。

5種鏈格孢菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確量取適量5種鏈格孢菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用50%乙腈水溶液逐步稀釋成0.5，1，2，5，10，20，50，100和200 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作液。按照1.3小節(jié)確定的儀器參數(shù)進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，分別得到5種鏈格孢菌毒素的線性方程和相關(guān)系數(shù)。同時分別計算3倍和10倍信噪比所對應(yīng)的濃度，作為方法的檢出限和定量限。

1.6 準(zhǔn)確度及精密度

為了考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，選取2個陰性番茄醬樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，進(jìn)行低、中、高3個水平的添加試驗，每個添加水平連續(xù)重復(fù)測定6次。按照1.4小節(jié)的方法進(jìn)行樣品前處理，在1.3小節(jié)確定的色譜和質(zhì)譜條件下測定，計算加標(biāo)樣品的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜分析2.1.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

分別配制質(zhì)量濃度為1 μg/mL的5種鏈格孢菌毒素單個標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用intellistart和手動優(yōu)化結(jié)合的方法，對每種鏈格孢菌毒素的離子模式（正/負(fù)）、母離子（錐孔電壓）、子離子（碰撞能量）等參數(shù)進(jìn)行選擇優(yōu)化，得到騰毒素、鏈格孢霉素、交鏈格孢酚單甲醚、鏈格孢酚及細(xì)交鏈格孢菌酮酸的最佳質(zhì)譜參數(shù)（見表1）。

2.1.2 分離條件的選擇

研究比較了不同有機相（甲醇和乙腈）與水相（添加甲酸）體系組成對5種鏈格孢菌毒素信號強度和分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在水相流動相中加入甲酸（0.05%，體積分?jǐn)?shù)）能有效地改善峰形，同時加入甲酸體系TEA的響應(yīng)良好。而在沒有添加甲酸的流動相體系中TEA不出峰，這可能是由于甲酸的加入更有利于TEA的離子化。同時在甲酸水-乙腈流動相體系中5種鏈格孢菌毒素的信號強度高于甲酸水-甲醇流動相體系，且色譜系統(tǒng)的整體壓力較低。因此選擇甲酸水-乙腈體系作為測定選定5種鏈格孢菌毒素的流動相。進(jìn)一步比較了水體系中不同甲酸添加量（0.05%，0.1%，0.2%，0.5%和1%）對5種鏈格孢菌毒素信號強度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5種鏈格孢菌毒素在0.1%甲酸水-乙腈流動相體系中回收率高于其他流動相體系（見圖1），故試驗選取0.1%甲酸水-乙腈體系作為分離5種鏈格孢菌毒素的流動相。

圖1 不同流動體系下5種鏈格孢菌毒素的比較

2.2 提取條件的選擇

研究結(jié)合文獻(xiàn)資料報道[1]選取乙腈作為提取溶劑，同時考察了乙腈中添加不同體積分?jǐn)?shù)甲酸（0，0.5%，1%，1.5%和2%）對提取效率的影響，結(jié)果如圖2所示。純乙腈作為提取溶劑對5種ATs的提取效率最高，尤其是TEA。這與其他文獻(xiàn)報道的甲酸乙腈作為提取溶劑不一致，造成這一結(jié)果的原因可能是番茄醬本身在制作過程中呈酸甜味，本身已經(jīng)具備酸性條件，所以乙腈直接作為提取溶劑對5種ATs的提取效率較高，并高于其他添加甲酸的提取溶劑。因此，試驗最終選取純乙腈作為最佳提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑下5種鏈格孢菌毒素的提取效率

2.3 凈化

研究考察了MgSO4、C18、PSA和GCB凈化吸附劑對番茄醬中5種ATs提取液的凈化效果。取2 mL待凈化液加入到預(yù)先分別裝有MgSO4（0.5 g）、C18（100 mg）、PSA（100 mg）和GCB（100 mg）的10 mL離心管中，同時加入10 ng ATs混合標(biāo)樣，在優(yōu)化的試驗條件下進(jìn)行分析測定，結(jié)果如圖3所示。MgSO4、C18和PSA的凈化效果明顯好于GCB的凈化效果，GCB對5種ATs具有一定的吸附作用，尤其是對AME和AOH組分，幾乎全部吸附。同時由圖3可以看出，PSA吸附劑對AOH的影響較大，回收率低于70%，而MgSO4和C18吸附劑對5種ATs的凈化效果好，回收率均超過80%。因此，試驗選取0.5 g MgSO4和100 mg C18混合吸附劑作為凈化吸附劑。

2.4 線性相關(guān)性

在上述儀器條件下進(jìn)行測定，采用外標(biāo)法定量，以MS/MS定量離子色譜峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出相應(yīng)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。由表2可知，5種鏈格孢菌毒素在0.5～200 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均在0.99以上。按3倍信噪比和10倍信噪比計算，5種鏈格孢菌毒素的檢出限均為1 μg/kg，定量限均為2.5 μg/kg。

表2 5種鏈格孢菌毒素的保留時間、線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

按照1.6小節(jié)進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度試驗，計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表3所示。由表3中回收率和SRSD數(shù)據(jù)可以看出，選取的2個陰性番茄醬樣品在3個添加水平下5種鏈格孢菌毒素的回收率在78.3%～104.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.2%～7.4%之間，結(jié)果表明該方法測定分析的結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。同時該方法將保留時間和化合物碎片信息結(jié)合，進(jìn)一步對化合物進(jìn)行定性，這大大降低了檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性或假陰性的可能。

表3 5種鏈格孢菌毒素的準(zhǔn)確度和精密度試驗結(jié)果（n=6）

2.6 實際樣品的測定

利用建立的方法對采自新疆石河子市面上的20個番茄醬樣品進(jìn)行了5種鏈格孢菌毒素檢測。圖4分別是標(biāo)準(zhǔn)品（圖4a）和實際樣品（圖4b）的提取離子質(zhì)譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所有檢測的番茄醬樣品中，有部分樣品檢出TEA組分，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在15～760 μg/kg之間。

圖4 5種鏈格孢菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品和實際樣品的MRM圖

3 結(jié)論

試驗對液相條件、質(zhì)譜條件、提取條件和凈化條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定番茄醬中騰毒素、鏈格孢霉素、交鏈格孢酚單甲醚、鏈格孢酚及細(xì)交鏈格孢菌酮酸的方法。該方法前處理簡單，檢測時間短，結(jié)果靈敏度高，整體線性關(guān)系、準(zhǔn)確度和精密度良好。運用該方法對購于新疆石河子地區(qū)市面上的20個番茄醬樣品進(jìn)行測定，結(jié)果表明部分番茄醬樣品中含有TEA組分，質(zhì)量濃度在15～760 μg/kg之間。該方法的建立為檢測番茄醬中鏈格孢菌毒素的檢測提供檢測依據(jù)，同時為檢測其他水果醬等制品中鏈格孢菌毒素的檢測提供技術(shù)參考。