褐藻膠裂解酶研究進展

吳陽，霍崢，李剛，溫少紅

煙臺大學生命科學學院（煙臺 264000）

褐藻膠存在于褐藻細胞壁及細胞間質(zhì)中，約占其干重的40%。褐藻膠是酸性陰離子線性多糖，由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronate；M）和與其C-5差向異構(gòu)體α-L-古羅糖醛酸（α-L-guluronate；G）通過1,4糖苷鍵共價連接，以均聚或隨機的方式排列成同源多糖醛酸M殘基（Poly M）、G殘基（Poly G）以及雜多糖醛酸（Poly MG或Poly GM）[1]。除褐藻外，褐藻膠也由兩個細菌屬——固氮菌（例如葡萄固氮菌Azotobactersp.）和幾種假單胞菌產(chǎn)生（例如銅綠假單胞菌Pseudomonosasp.）。

褐藻寡糖（AOS）由褐藻膠降解產(chǎn)生，除保留褐藻膠的優(yōu)良特性外還具有特殊的化學特性及生物活性，具有更廣泛的應用價值。在食品方面作為食品添加劑，農(nóng)業(yè)方面作為植物生長促進劑和治療劑，醫(yī)藥方面具有抗氧化和抗腫瘤等特性，在能源方面將褐藻膠降解為寡糖是將其直接轉(zhuǎn)化為乙醇的關(guān)鍵步驟[2-5]。

褐藻膠的降解方法有物理法、化學法和酶解法。酶解法具有底物專一、反應條件溫和等優(yōu)點，還可以定向制備褐藻寡糖，相較于物理、化學法是一種理想且環(huán)保的方法。但是褐藻膠裂解酶的應用目前仍處于研究階段，無法投入工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。

1 褐藻膠裂解酶的來源

迄今為止，許多褐藻膠裂解酶已被鑒定、基因克隆和純化，其來源多種多樣，例如從海帶、馬尾藻、土壤中分離得到的海洋和陸地細菌、真菌、噬菌體和病毒（小球藻病毒）等，以褐藻為食的海洋軟體動物（鮑魚Haliotis spp.、海兔Aplysia kurodai、短濱螺Littorina brevicula等）的腸道中也存在著褐藻膠裂解酶。特別地，Stender等[6]從人腸道細菌—溶胞擬桿菌中分離得到褐藻膠裂解酶BeclPL6。

目前對細菌產(chǎn)的褐藻膠裂解酶的研究較為廣泛和深入，已鑒定出50000多個褐藻膠裂解酶氨基酸序列，其中47000個屬于細菌基因組，包括弧菌屬Vibriosp.[7-8]、吞噬性去氟弧菌Defluviitalea phaphyphila[9]、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonassp.[10]、銅綠假單胞菌屬Pseudomonas aeruginosa[11]、卡拉膠假單胞菌屬Pseudoalteromonas carrageenovora[12]、芽孢桿菌屬Paenibacillus[13]、溶胞擬桿菌Bacteroides cellulosilyticus[6]、微鱗球菌Microbulbifersp.[14-16]、志賀氏菌Shewanellasp.[17]、嗜鹽白蟻菌Zsoptericola halotoleransWX[18]等。

2 褐藻膠裂解酶的作用方式

褐藻膠裂解酶通過β-消除的酸堿催化作用，以1,4O-糖苷鍵為目標，將褐藻膠降解為帶有不飽和雙鍵的寡糖，并在非還原末端形成不飽和殘基，用符號Δ表示[19]。褐藻膠裂解酶的β-消除作用如圖1所示。

圖1 褐藻膠裂解酶的β-消除

Gacesa[20]提出了一種褐藻膠裂解酶的新的催化假說，描述了β-消除反應的三個步驟：（1）去除羧酸鹽陰離子上的負電荷，通過鹽橋（組氨酸和賴氨酸）中和電荷，降低H-5質(zhì)子的pKa；（2）一般堿催化提取C-5上的質(zhì)子，其中可能需要一個殘基作為質(zhì)子提取者，另一個作為質(zhì)子供體或殘基同時充當質(zhì)子供體和受體，得到稀酸鹽中間體；（3）羧基的電子轉(zhuǎn)移導致C-4和C-5之間形成雙鍵，并最終裂解O-糖苷鍵。

3 褐藻膠裂解酶的分類

3.1 根據(jù)分子量大小

根據(jù)分子質(zhì)量，將褐藻膠裂解酶分為三類：第一類分子質(zhì)量在20～35 kDa之間[13-14]；第二類分子質(zhì)量約為40 kDa[21-22]；第三類分子質(zhì)量約為60 kDa[10]。特別地，ZH0-Ⅰ分子質(zhì)量為91 kDa，ZH0-Ⅳ分子質(zhì)量為113 kDa[10]。

3.2 根據(jù)底物特異性

將褐藻膠裂解酶分為1,4-β-D-聚甘露糖醛酸裂解酶（EC 4.2.2.3），1,4-α-L-聚古羅糖醛酸裂解酶（EC 4.2.2.11），以及在兩者中均顯示活性的雙功能酶。目前已報道多種雙功能裂解酶，Tavafi等[11]在銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)了既能降解Poly M，又能降解Poly G的雙功能褐藻膠裂解酶。

3.3 根據(jù)作用方式

褐藻膠裂解酶可被分為內(nèi)切酶和外切酶，外切酶也可稱為寡褐藻膠裂解酶（EC 4.2.2.26）。迄今為止大部分褐藻膠裂解酶為內(nèi)切酶，主要產(chǎn)物為不飽和寡糖（2-4糖）。不飽和寡糖無法直接轉(zhuǎn)化為生物燃料，而外切褐藻膠裂解酶作用于褐藻膠或褐藻寡糖的非還原末端，釋放出的不飽和殘基DEH，可用作生物燃料[5]，生物燃料的生產(chǎn)突出了外切型褐藻膠裂解酶的意義。表1是近年發(fā)現(xiàn)的外切褐藻膠裂解酶。

表1 外切褐藻膠裂解酶

3.4 根據(jù)序列相似性

根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫（www.CAZy.org/olysaccharide-Lyases.html），褐藻膠裂解酶分為12個多糖裂解酶家族（PLs），包括PL5，PL6，PL7，PL14，PL15，PL17，PL18，PL31，PL32，PL34，PL36和PL39。Helbert等[29]研究表明，PL32，PL34和PL36是新建立的，PL36包括39個細菌序列和一個真菌序列[30]。Ji等[9]從Defluviitalea phaphyphilaAlg1中分離出新的PL39家族的褐藻膠裂解酶。

大多褐藻膠裂解酶屬于PL-5和PL-7家族，且多為Poly M裂解酶。但PL-7家族中也包含一部分Poly G裂解酶，對于重組酶Aly1281[12]，Poly G的裂解優(yōu)于Poly M。近年來PL-6家族的褐藻膠裂解酶也被廣泛分離出來。PL-6家族中多為Poly G裂解酶，例如Lyu等[8]從弧菌OU02中分離出的第一個單域結(jié)構(gòu)的褐藻膠裂解酶AlyF是Poly G裂解酶。但也有例外，如SHA-4是PL6家族中第一個對PolyMG有底物偏好性的外切型褐藻膠裂解酶[26]，BeclPL6[6]為Poly M褐藻膠裂解酶。

3.5 根據(jù)折疊類型

褐藻膠裂解酶可分為3個折疊類型：β-jelly roll class（PL7，PL14，PL18和PL36）、（α/α）n環(huán)折疊（PL5，PL15和PL17）和β-螺旋（PL6）[31]。AlgNJU-03[7]及Aly36B[30]分別屬于PL-7和PL-36家族，結(jié)構(gòu)均為β-jelly roll。PL6家族的PsAly[13]及BeclPL6[6]均為β-螺旋結(jié)構(gòu)。

4 褐藻膠裂解酶的酶活測定方法

4.1 初篩——平板測定法

以褐藻膠為唯一碳源，對褐藻膠裂解酶進行定性篩選，包括乙醇法、碘液法、CaCl2法、十六烷基氯化吡啶（CPC）等，未被水解的底物會被染色或形成白色沉淀。

Sawant等[32]首次提出用革蘭氏碘代替CPC：革蘭氏碘2～3 min即可清楚形成對比區(qū)域，而CPC法至少需要30～40 min，且培養(yǎng)基中的瓊脂會干擾CPC的作用。因此革蘭氏碘是目前使用平板篩選褐藻膠裂解酶產(chǎn)生菌的最佳方法。

4.2 復篩

復篩即定量測定，包括紫外吸光光度法[33]、硫代巴比妥酸法（TBA法）[24]、3,5-二硝基水楊酸法（DNS定糖法）、黏度法等。魏丹等[18]提出了改良版的DNS法，采用0.1 mL酶與1 mL底物反應，沸水滅活3 min，該方法可以減少發(fā)酵液中原本的還原糖對顯色的影響。近年來紫外法及DNS法應用較為廣泛，但因試驗條件的不確定性以及酶活單位定義的不同，各種測定方法之間還無法完全進行比較。

5 菌株產(chǎn)酶酶活的提高

對發(fā)酵條件的優(yōu)化可以提高菌株產(chǎn)酶酶活。例如菌株大多需要褐藻膠誘導產(chǎn)酶；海洋細菌對NaCl含量要求較高，且大多褐藻膠裂解酶對Na+具有依賴性；另外金屬離子對酶與底物結(jié)合時的電荷有影響，使得部分金屬離子對酶活具有促進或抑制作用[18]。

由于部分野生菌的不穩(wěn)定性以及酶活較低，對其進行編碼重組可以獲得更高酶活的褐藻膠裂解酶。Hu等[33]將Aly7B重組為Aly7B-CDⅠ和Aly7B-CDⅡ，僅Aly7B-CDⅡ具有褐藻膠裂解酶的酶活，且酶活提高了近6倍。Li等[22]將重組褐藻膠裂解酶AlyPL6固定在MTOP上，可以提高其熱穩(wěn)定性和重復利用性，使其在工業(yè)上得到更充分的應用。因此，在編碼重組及固定化的基礎(chǔ)上進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，可以得到更高酶活及優(yōu)良生物活性的褐藻膠裂解酶。

6 褐藻膠裂解酶的酶學性質(zhì)

不同的褐藻膠裂解酶的酶學性質(zhì)不盡相同，對酶學性質(zhì)的研究可以使酶發(fā)揮出最大潛力。

研究表明褐藻膠裂解酶最適溫度范圍為30～50℃，但也有例外，高楊等[21]從印度尼西亞的熱泉樣品中分離出的褐藻膠裂解酶AlyB5的最適溫度為65 ℃，在70 ℃時仍保持75%以上的酶活；而Itoh等[13]克隆出的褐藻膠裂解酶PsAly的最適溫度在67 ℃，在37 ℃保存24 h，酶活仍保留50%以上，隨著溫度升高，其半衰期的出現(xiàn)時間越短。

褐藻膠裂解酶的最適pH約為6.0-8.0，特別的，Li等[22]克隆出的AlyPL6的最適pH為10；嚴芬等[34]篩選的褐藻膠裂解酶的最適pH為5.5，偏酸性。

不同金屬離子會對褐藻膠裂解酶的活性產(chǎn)生影響，少數(shù)幾個在多金屬離子條件下表現(xiàn)出高活性，還有部分受到某些金屬離子的抑制作用。He等[10]在鞘氨醇單胞菌中分離克隆了3個內(nèi)切酶及一個外切酶，Hg2+對這四種酶的活性均有促進作用，同時也存在其他金屬離子對克隆出的4個酶有促進或抑制作用。AlgNJU-03的酶活在含有Ca2+、Fe2+或Co2+環(huán)境中提高，特別是Ca2+對其酶活促進作用最為明顯[7]。Ca2+對較多的褐藻膠裂解酶的酶活具有促進作用，但也有例外，比如AlyF具有鈣不依賴性[8]，Ca2+對Aly17B具有抑制作用[35]等。

Zhu等[14]從Microbulbifersp.ALW1中分離出的褐藻膠裂解酶在0.5 mol/L Na+作用下酶活提高5.1倍。重組酶Aly1281[12]具有明顯的耐鹽性，使其可以應用于褐藻的工業(yè)酶法加工而無需進行水密集的脫鹽處理。

7 褐藻膠裂解酶的應用

褐藻膠裂解酶可應用于食品、農(nóng)業(yè)、制藥及能源等方面，其不僅可以降解褐藻膠，定向制備褐藻寡糖，也可用于闡明褐藻膠的細微結(jié)構(gòu)、制備海藻原生質(zhì)體、發(fā)酵生產(chǎn)乙醇、降解生物膜等。

7.1 功能性低聚糖的制備

褐藻膠內(nèi)切酶是將褐藻膠生產(chǎn)為功能性低聚糖（2-5糖）的關(guān)鍵工具，不同聚合度的褐藻寡糖的應用也不盡相同。低分子質(zhì)量（500～3000 Da）和較高的M/G比（＞1）的褐藻寡糖能更好地促進植物的生長[2]。Zhang等[3]和Zhu等[14]發(fā)現(xiàn)的褐藻膠裂解酶產(chǎn)的二糖均具有抗氧化活性。Chen等[4]分離出4個不同聚合度（DPs）的寡糖，但在這些寡糖中僅五糖對骨肉瘤細胞顯示抗腫瘤功能。

7.2 褐藻膠精細結(jié)構(gòu)的闡明及海藻原生質(zhì)體制備

褐藻膠裂解酶也可用于分析或修飾褐藻膠的精細結(jié)構(gòu)。Aarstad等[1]采用H-1 NMR，HPAEC-PAD和SEC-MALLS等方法分析降解的反應產(chǎn)物和分離的褐藻膠片段，實現(xiàn)褐藻膠的測序。褐藻膠裂解酶也可以制備藻類的原生質(zhì)體，應用于基因工程和獲得再生植株。Inoue等[36]發(fā)現(xiàn)褐藻膠裂解酶可以分解凝膠結(jié)構(gòu)，進而有效地從日本粳稻葉片中分離出原生質(zhì)體。

7.3 發(fā)酵生產(chǎn)乙醇

褐藻膠作為生產(chǎn)生物乙醇的可再生資源，已引起越來越多的關(guān)注。褐藻膠、甘露醇和葡萄糖的分解代謝產(chǎn)生了丙酮酸鹽，可以從中合成大量的燃料，Wargacki等[5]建立了生產(chǎn)乙醇的微生物平臺，其產(chǎn)量可以達到理論值的80%。目前僅在實驗室條件下采用工程菌株生產(chǎn)乙醇，還無法完全應用于工業(yè)生產(chǎn)。

7.4 生物膜的降解及囊性纖維化的治療

褐藻膠裂解酶能夠降解細菌分泌的褐藻膠形成的生物被膜，增強抗生素的滲透性。部分抗生素（妥布霉素、頭孢克肟）與褐藻膠裂解酶具有協(xié)同作用，可以促進生物膜的根除，相反也有的抗生素（環(huán)丙沙星）與褐藻膠裂解酶的結(jié)合顯示拮抗作用[11]。褐藻膠裂解酶在囊性纖維化的治療中也顯示出巨大的潛力，Wan等[37]創(chuàng)建了銀納米復合材料，遞送兩種藥物化合物（褐藻膠裂解酶和頭孢他啶）以降解褐藻膠并從肺部根除銅綠假單胞菌。

8 結(jié)語

目前已經(jīng)分離并鑒定了各種來源的褐藻膠裂解酶，這些酶具有不同的結(jié)構(gòu)、作用方式和底物特異性，其酶學性質(zhì)也是多種多樣的，可應用于食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和能源等領(lǐng)域。

雖然目前關(guān)于褐藻膠裂解酶的研究有很大進展，但仍有許多工作要做。目前發(fā)現(xiàn)的褐藻膠裂解酶的穩(wěn)定性較低，使其僅處于實驗室水平，很少應用于工業(yè)中，因此分離出活性高和穩(wěn)定性好的新型酶對于褐藻膠裂解酶的研究和工業(yè)發(fā)展都具有重要意義。