病證結合動物模型研究思路述評

鐘森杰，李靜，李琳，胡思遠，楊夢，黃淑敏，熊霞軍，胡志希

病證結合動物模型研究思路述評

鐘森杰，李靜，李琳，胡思遠，楊夢，黃淑敏，熊霞軍，胡志希

湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷研究所，湖南 長沙 410208

病證結合動物模型是中西醫(yī)結合基礎研究的有效工具，在模型運用過程中仍有部分問題亟待解決。本文總結現(xiàn)階段兩類病證結合動物模型研究思路，對病因與證因的時序性關系、正向評價與逆向反證的可信度關系、不施加證因的合理性等研究中涉及的問題進行論述，提出相應的發(fā)展思路，以期為進一步研究提供借鑒。

病證結合；動物模型；構建思路；評價方法

西醫(yī)學“病”以病理學為核心，中醫(yī)學“證”以病機學為核心，病證結合是中西醫(yī)結合研究的關鍵[1]。病證結合動物模型是中西醫(yī)結合模式發(fā)展過程中的衍生產(chǎn)物，特點是“病”與“證”特征信息在同一動物身上的模擬，其較單純“病”或單純“證”模型更具說服力[2]。病證結合動物模型是現(xiàn)階段中醫(yī)藥基礎研究的重要載體，模型質量高低關系著中醫(yī)藥現(xiàn)代化進程。因此，筆者概述現(xiàn)階段兩類病證結合動物模型研究思路，對研究中存在的問題進行論證分析，并提出相應的發(fā)展思路。

1 病證結合動物模型構建方法

病證結合動物模型制備思路可概括為兩大類：一是病理病因復合因素造模，將導致“病”形成的病理因素與“證”形成的病因因素先后或同步施加于實驗動物；二是疾病模型辨證造模，即不施加與“證”相關的致病因素，通過正向思維評價或逆向思維反證，從疾病模型中探尋中醫(yī)證候屬性。

1.1 先后施加病因與證因

將導致“病”與“證”形成的因素先后疊加于實驗動物身上，即在西醫(yī)“病”模型基礎上建立中醫(yī)“證”模型，或在中醫(yī)“證”模型基礎上建立西醫(yī)“病”模型，使模型同時具備“病”與“證”的特征，是當前許多學者的主要思路[3]。如曾梅艷等[4]先以灌服番瀉葉水煎劑結合游泳力竭的“苦寒瀉下＋勞倦過度”法建立脾胃虛寒證模型，再通過灌服無水乙醇與阿司匹林復制十二指腸潰瘍模型；肖青青等[5]先通過不確定性空瓶應激法研制廣泛性焦慮癥模型，再以剝奪睡眠法建立心陰虛證模型；徐攀等[6]以腹主動脈縮窄術構建慢性心力衰竭模型，術后2周通過寒冷刺激法模擬“寒象”以建立心陽虛證模型。

病理病因先后疊加是病證結合模型制備的經(jīng)典思路，這一方法遵循了臨床實際中“病”與“證”相互依附性特點，避免二者相互獨立，模型在符合中醫(yī)學病因病機理論的基礎上也具有明確的病理效應，實現(xiàn)疾病共性規(guī)律與個體個性特征的有機結合。但亦有部分學者對此提出質疑，無論是“先病后證”或“先證后病”的制備方法，后續(xù)施加因素都可能使原有的模型發(fā)生改變，結果導致“病”或“證”難以達到既定要求，同時過多的人為施加因素必然影響模型的穩(wěn)定性與可靠性[7]。

1.2 同步施加病因與證因

鑒于西醫(yī)病理因素與中醫(yī)病因因素在模型制備中的先后主次關系仍存爭議，故有學者采用同步施加2種因素的方法，以求病證同塑。如武曲星等[8]同步采用睡眠剝奪復合免疫法建立免疫性血小板減少癥氣不攝血證模型；苗宇船等[9]同步運用高糖高脂飲食、慢性束縛應激刺激、飲食不節(jié)的復合因素法，成功制備非酒精性脂肪性肝炎肝郁脾虛證模型?！安　迸c“證”存在縱橫交錯的復雜關系，疾病的發(fā)生發(fā)展過程中伴隨著證候的動態(tài)變化，兩者并非截然對立[10]。相較于“病＋證”或“證＋病”的先后疊加模式，病證同塑的制備方法更為貼近病證的演變規(guī)律，確保兩者的協(xié)同性。但仍存在部分不成熟之處，如在同一時間節(jié)點內施加多種干預因素，多種因素可能相互干擾，其模型制備方法有待進一步優(yōu)化。

1.3 正向評價疾病模型證候屬性

“證”并非游離于“病”之外，兩者實質上相互依存，在疾病不同階段會出現(xiàn)不同的證候表現(xiàn)[11]。因此，有學者認為“證”的出現(xiàn)不需額外干預因素，某些成熟穩(wěn)定的疾病模型可能具有中醫(yī)學“證”的特點，故可通過宏觀表征及微觀指標評價其證型，從而確立可靠的病證結合模型。如吳智春等[12]從肛溫、舌色、抓力、學習記憶、血清雌二醇與睪酮表達等方面評價晚期自發(fā)性高血壓大鼠的證候特征，結果發(fā)現(xiàn)該模型屬肝腎陰虛證。由于“證”的動態(tài)可變性特點，亦有學者全局性地評價疾病過程中的證候變化特點，如廉洪建[13]從心功能指標、組織形態(tài)學、行為學等方面評價主動脈弓縮窄術誘導心衰模型的中醫(yī)證候演變規(guī)律，發(fā)現(xiàn)不同時間窗呈現(xiàn)出不同證候特征，表現(xiàn)為“氣虛-氣虛血瘀-氣虛血瘀水停”的演變規(guī)律。

鑒于實驗動物與人體在行為學表現(xiàn)、組織學結構等方面存在顯著差異，此類參照臨床實際的辨證體系未必適用于實驗動物，而目前亦尚未形成規(guī)范化的實驗動物四診信息提取手段與辨證標準，某些癥狀與體征為研究者主觀獲取，致使當前研究結果的可信度與說服力不足[14]。另一方面，微觀指標與證候的關系仍在探索中，單個指標無法全面闡釋證候本質，且部分研究所選指標并非“證”的特異性指標。辨證規(guī)范化是證候動物模型研究的重點和難點，近年來已有部分學者進行創(chuàng)新嘗試，如魏盛等[15]提出完善量表質量考核體系，方肇勤等[16]建設大小鼠四診工作站，上述舉措為研究者提供了新思路。

1.4 逆向反證疾病模型證候屬性

由于正向評價的主觀性與模糊性，故有學者傾向于運用逆向思維反證疾病模型的證候屬性，其中以“以方測證”最具代表性?！耙苑綔y證”即觀察運用方藥后所出現(xiàn)的藥效反應，基于方藥療效逆向推測出模型證型[17]。如李欣春等[18]發(fā)現(xiàn)，益氣養(yǎng)陰法對高血壓心衰模型的療效顯著優(yōu)于益氣溫陽法，由此推測該模型屬心氣陰虛證；劉喜平等[19]比較參苓白術散和痛瀉要方對三硝基苯磺酸誘導潰瘍性結腸炎模型的干預作用差異，發(fā)現(xiàn)痛瀉要方療效較優(yōu)，據(jù)此推測該模型所屬證型為肝郁脾虛證?！耙苑綔y證”法以“方證對應”理論為邏輯基礎，此法在醫(yī)理上具有可行性，因此有學者提出方藥反證是評價證型的有效途徑[20]。但中藥方劑亦存在多效應、多靶點的療效特性，同一方藥可對多種證型起治療作用，因此在研究中還需合理設計排他對照實驗、界定方藥療效、規(guī)范療效評判等多個環(huán)節(jié)，以確保研究結果的特異性[21]。

2 病證結合動物模型關鍵問題

病證結合動物模型是開展中醫(yī)藥基礎研究的有效工具，相應的制備思路與方法亦日趨成熟，現(xiàn)已廣泛應用于“證”本質研究領域。

2.1 病因與證因時序性關系

關于病理病因復合因素造模法的爭論點，多集中于施加因素的先后主次關系，即應先建立“病”模型或先建立“證”模型，抑或病證同塑。有學者指出“先病后證”制備方法更易被接受[22]。究其成因，一方面在于遵循以病統(tǒng)證的研究框架，即以疾病為綱、以證候為點開展研究，“證”被“病”限定在一定范圍內而更為精準，“先病后證”制備方法亦與“先辨病、后辨證”的臨床診斷思路相契合；另一方面，“證”具有動態(tài)可變特點，其穩(wěn)定性低于“病”，若在“證”模型基礎上再次施加額外干預因素，“證”更易受擾動而發(fā)生改變。而當病證同塑時，因證候可能在疾病的形成過程中不斷變化，故也應保持“病”的主體地位，依據(jù)所選疾病模型特點合理施加證因，以將疾病模型證候化。但亦有部分學者通過“先證后病”制備方法成功建立相應模型，不同思路孰優(yōu)孰劣，還需更具說服力的研究證據(jù)方能充分檢驗[23]。

2.2 正向評價與逆向反證可信度關系

病證結合模型要求動物具備中醫(yī)學“證”的特征，而對未施加證因的單純疾病模型，合理的證候評價體系尤為關鍵?，F(xiàn)階段的評價體系存在如下問題：①癥狀是臨床辨證的主要依據(jù)，但人體癥狀只能在實驗動物上實現(xiàn)一定程度的模擬，并不能完全對等，某些癥狀表現(xiàn)不顯著的模型甚至會“無證可辨”，如何將動物癥狀信息客觀化、定量化仍是亟待解決的難題[24-25]；②借助先進檢測技術獲取的客觀指標，雖可彌補動物癥狀信息的局限性，但受限于“證”本身的復雜性，當前缺乏可用于明確診斷的特異性指標，客觀指標與“證”的關系仍在探索中；③“以方測證”法以方藥療效為依據(jù)而更具客觀性，但對于此法的合理性和可行性仍存在較大爭議[26]。鑒于尚未形成統(tǒng)一的證候評價共識，已有學者提出癥狀為本證、病因為正證、方藥療效為反證、客觀指標與相關因素為佐證的動物模型多元診斷體系[27]。筆者認為，在現(xiàn)存辨證體系與技術手段條件下，應以正向評價為主，同步納入宏觀癥狀與微觀指標，只有當模型生物學表征貼近人體證候表現(xiàn)的基礎上方可確立其證候屬性，同時輔以逆向反證法作為正向評價的支撐依據(jù)，2種方法協(xié)同判定、相互印證。

2.3 不施加證因的合理性

前文已提及病證結合模型制備思路可概括為兩大類，2種思路的根本差異在于是否施加導致“證”形成的致病因素。縱觀現(xiàn)階段“?。C”造模思路，看似是將病證有機結合，實則將兩者孤立而言，如胃潰瘍脾氣虛證、萎縮性胃炎脾氣虛證、疲勞綜合征脾氣虛等模型中，復制脾氣虛證的游泳力竭、過食苦寒藥物等方法，均與“病”的形成無直接因果關系。缺乏邏輯關系地將病理因素與病因因素強行疊加，這一思路否定了病證間的內在必然聯(lián)系?！白C”是疾病過程中某一階段或某一類型的病理概括，即疾病的某一階段都存在既定證型，若研究者另有目的地疊加因素而設立另一證型，必然導致所造證型與疾病階段不相吻合，脫離臨床實際。

最理想的病證因素疊加制備模式，是“病”模型和“證”模型制備方法均為穩(wěn)定的、客觀的，且2種因素相互疊加具有合理邏輯關系，與病證的自然形成過程相吻合。但受限于諸多因素，這一設想難以真正實現(xiàn)[28]。筆者認為，病證結合動物模型成功建立的依據(jù)應是模型能同時體現(xiàn)出“病”與“證”的雙重特征，若能通過宏觀表征、微觀指標、方藥療效等現(xiàn)行方法驗證某些疾病模型已確實存在“證”的特征，“證”既已形成則無需額外施加證因。未施加證因的病證結合模型，因干預因素減少而更穩(wěn)定可靠，體現(xiàn)了中醫(yī)學對“病”的辨證規(guī)律與認識特點，切合臨床實際而更具應用前景。

3 病證結合動物模型發(fā)展思路

現(xiàn)階段的病證結合動物模型研究已取得顯著進展，但在運用過程中仍暴露出部分不足及可探索之處。如何創(chuàng)新研究思路、優(yōu)化技術手段，充分發(fā)揮優(yōu)勢與彌補局限，是亟需思考的重要問題。

3.1 開展標準化建設

病證結合動物模型的各項標準建設工作仍相對滯后，存在動物種屬差異、造模因素繁雜、證型界定分歧等問題，現(xiàn)行標準指導下的病證結合模型難以完全實現(xiàn)“病-證-癥”統(tǒng)一[29]。此外，當前各類模型的建立及鑒定多由各研究團隊獨立完成，思維角度各有差異，致使各研究結果相對獨立，相互之間難以比較驗證，阻滯礙有效模型的推廣應用。因此，病證結合動物模型應從動物種屬遴選、干預手段、評價體系等方面開展標準化建設。可借鑒臨床診斷標準的建設思路，由衛(wèi)生部門、行業(yè)學會等官方組織牽頭，以人體臨床表現(xiàn)為參照，結合不同種屬動物的生物學特性，優(yōu)化人為干預因素，遴選關聯(lián)癥狀與指標并量化賦分，逐步形成可行、客觀的操作細則與評價體系，并在實踐中不斷修訂完善。

3.2 引入系統(tǒng)生物學

重視新興學科介入是解決當前困境的關鍵途徑，筆者認為可將系統(tǒng)生物學技術引入其中。系統(tǒng)生物學包括基因組學、代謝組學、蛋白質組學等“組學”技術，以“整合”為指導思想，與中醫(yī)學整體觀念相契合，先進的生物學檢測技術亦可彌補傳統(tǒng)四診方法的局限[30]。當病證結合模型建立時，即可在傳統(tǒng)表征信息基礎上，通過同病異證、異病同證間比較篩選特異性生物標志物，揭示相關聯(lián)的生物學網(wǎng)絡變化，并以此為潛在靶點檢驗方藥療效。系統(tǒng)生物學旨在遴選相互關聯(lián)的群體性指標，此類群體性指標在整體層面上揭示模型的多水平指征變化，突破了客觀指標單一解釋能力的局限，是“證”本質研究的拓展與深化，并將有助于建立客觀、合理且具有中醫(yī)學特色的模型評價體系[31]。

3.3 建立中醫(yī)學病證結合模型

傳統(tǒng)的中醫(yī)診療模式強調病證結合，此處的“病”實則指中醫(yī)學病名，如郁證、癇病等。而當前病證結合模式則是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的創(chuàng)造性探索，但以西醫(yī)學疾病替代中醫(yī)學病名則過于牽強，并不完全符合中醫(yī)學理論[32]。因此，中醫(yī)學的“病”與“證”疊加，如眩暈肝陽上亢證、心悸心血瘀阻證等，最能體現(xiàn)中醫(yī)特色優(yōu)勢的造模思路。但這一思路目前只停留于理論構想階段，此類模型的制備與評價尚不成熟，國內鮮有文獻報道。今后研究重點應在促進“證”研究深入的同時，注重推動中醫(yī)學“病”的現(xiàn)代化進程，以期建立中醫(yī)學的病證結合模型。

4 小結

病證結合模型因其特有的優(yōu)勢已被廣泛應用于中醫(yī)藥基礎研究領域，并逐步形成多元化的模型研究思路。就前文闡述的兩類模型制備方法而言，各自理論體系已趨于成熟，相應的文獻報道亦日漸增多。但目前仍處于研究的發(fā)展階段，部分關鍵問題有待突破，如各施加因素合理性及相互之間的時序性關系、各評價方法的可信度等，應借助現(xiàn)代技術進一步創(chuàng)新思路、完善體系，使其成為理想的研究載體[33]。近年來有學者提出建立動物體質量表，制備“體質-病-證”三位一體模型[34]，這一新思路可供研究者借鑒。

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A Review of Research Ideas in Combination of Disease and Syndrome Animal Models

ZHONG Senjie, LI Jing, LI Lin, HU Siyuan, YANG Meng, HUANG Shumin, XIONG Xiajun, HU Zhixi

Animal models of combination of disease and syndrome are an effective tool for basic research on the integrated traditional Chinese and Western medicine. However, some problems still need to be solved in the application of the models. This article concluded the research ideas of two types of animal models of combination of disease and syndrome, discussed the key issues involved in the research, such as temporal relationship between the cause of disease and syndrome, credibility of positive evaluation and negative evidence, and reasonability without the cause of syndrome, etc., and put forward corresponding development ideas, in order to provide references for further research.

combination of disease and syndrome; animal model; construction idea; evaluation method

R2-05；R285

A

1005-5304(2021)08-0141-04

10.19879/j.cnki.1005-5304.202012001

國家自然科學基金（81774208）；湖南省自然科學基金（2020JJ4062、2020JJ5408、2019JJ50447）

胡志希，E-mail：515800272@qq.com

（收稿日期：2020-12-01）

（修回日期：2020-12-16；編輯：華強）