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    基于PI3K/Akt/mTOR信號通路的三七總皂苷調控自噬抗H9c2細胞缺氧/復氧損傷機制研究

    2021-08-14 02:12:04王飄鄭晴胡婷張海銀許言午包怡敏
    中國中醫(yī)藥信息雜志 2021年8期
    關鍵詞:總皂苷溶酶體貨號

    王飄,鄭晴,胡婷,張海銀,許言午,包怡敏

    基于PI3K/Akt/mTOR信號通路的三七總皂苷調控自噬抗H9c2細胞缺氧/復氧損傷機制研究

    王飄,鄭晴,胡婷,張海銀,許言午,包怡敏

    上海中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院,上海 201203

    探討三七總皂苷(PNS)能否通過PI3K/Akt/mTOR信號通路調控自噬從而減輕H9c2細胞缺氧/復氧損傷機制。將H9c2細胞分為正常組、缺氧/復氧(A/R)組、A/R+PNS組、A/R+PNS+雷帕霉素(Rapa)組、A/R+Rapa組、A/R+羥氯喹(HCQ)組、A/R+3-甲基腺嘌呤(3-MA)組。通過缺氧6 h、復氧2 h建立H9c2細胞A/R模型。CCK-8法檢測細胞存活率,乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒檢測細胞損傷,Western blot檢測自噬相關蛋白Atg5、p62、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白PI3K、Akt、mTOR的表達,熒光法觀察細胞自噬流。與正常組比較,A/R組H9c2細胞存活率明顯下降,細胞損傷率明顯升高(<0.05),自噬相關蛋白Atg5、Beclin-1表達和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高(<0.05),自噬體和自噬溶酶體數(shù)量顯著增加,自噬流顯著增強(<0.05);與A/R組比較,用PNS預處理后,H9c2細胞存活率明顯上升,細胞損傷率明顯降低(<0.05),自噬相關蛋白Atg5、Beclin-1表達和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯降低(<0.05),p62蛋白表達明顯升高,與自噬抑制劑HCQ、3-MA作用相似,熒光結果顯示,PNS對自噬流有明顯抑制作用(<0.05);PNS預處理后p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達明顯升高(<0.05)。PNS能有效減輕H9c2細胞A/R損傷,其機制與激活PI3K/Akt/mTOR信號通路從而抑制自噬流相關。

    三七總皂苷;缺氧/復氧損傷;自噬;PI3K/Akt/mTOR信號通路;H9c2細胞

    缺血性心臟病發(fā)病率逐年上升,迄今已成為發(fā)病率及致死率最高的疾病之一[1]。雖通過藥物或手術等手段可達到恢復血流灌注的目的[2],但恢復過程中可引起不可逆的心肌組織損傷,即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)[3]。目前研究表明,細胞自噬作為內源性調節(jié)機制參與到MIRI過程中[4],抑制過度自噬可減輕MIRI[5]。研究發(fā)現(xiàn),激活PI3K/Akt/mTOR信號通路可抑制自噬并減少細胞氧化應激的發(fā)生[6-7]。中藥毒副作用小、安全性高,對MIRI防治效果較好。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),三七主要成分三七總皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)能通過抗氧化應激、抗凋亡等途徑減輕MIRI[8-9],但其能否通過調節(jié)自噬減輕MIRI仍不清楚。因此,本研究通過觀察PNS對缺氧/復氧H9c2細胞的影響,運用自噬激動劑及自噬抑制劑等工具藥,觀察PNS對自噬流的作用,探討PNS能否通過PI3K/Akt/mTOR信號通路調控自噬流,從而達到減輕MIRI的目的。

    1 材料與方法

    1.1 細胞株和藥物

    H9c2細胞,中國科學院上海細胞庫。血栓通注射液(成分PNS),昆明制藥集團股份有限公司,批號13HK03;自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA),MCE,批號HY-19312;自噬抑制劑羥氯喹(HCQ),Selleck,批號S4430;自噬激動劑雷帕霉素(Rapa),MCE,批號HY-10219。

    1.2 主要試劑與儀器

    CCK-8,上海翊圣生物科技有限公司,批號40203ES76;乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒,同仁化學研究所,批號CK12;DAPRed,同仁化學研究所,批號D677;DALGreen,同仁化學研究所,批號D675;SQSTM1/p62(CST,貨號5114s)、Beclin-1(CST,貨號3495s)、LC3B/MAP1LC3B(Novus,貨號NB100-2220)、Atg 5(CST,貨號12994s)、Akt(CST,貨號4691s)、p-Akt(CST,貨號4060s)、PI3K(CST,貨號4257S)、p-PI3K(Abcam,貨號ab182651)、mTOR(CST,貨號2983S)、p-mTOR(CST,貨號5536S)抗體。全自動凝膠成像系統(tǒng),上海天能公司,型號Tanon-2500;激光共聚焦顯微鏡,德國徠卡,型號TCS SP8;細胞培養(yǎng)箱,美國Thermo Scientific,型號class100;超凈臺,蘇州凈化設備公司,型號SW-CS-IFD。

    1.3 分組、造模及給藥

    將H9c2細胞分為正常組、缺氧/復氧(A/R)組、A/R+PNS組、A/R+PNS+Rapa組、A/R+Rapa組、A/R+HCQ組、A/R+3-MA組。造模前H9c2細胞分別用含PNS(100 μg/mL)、Rapa(50 nmol/L)、HCQ(50 μmol/L)、3-MA(5 mmol/L)的培養(yǎng)液處理2 h。A/R模型制備時,細胞培養(yǎng)液更換為含/不含藥物的無血清培養(yǎng)液,將培養(yǎng)皿置于缺氧條件下(95%N2和5%CO2)培養(yǎng)6 h,之后培養(yǎng)液更換為含/不含藥物的正常培養(yǎng)液,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。正常組細胞正常條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。

    1.4 細胞存活率檢測

    將細胞按1×105個/孔鋪于96孔板,另設只添加培養(yǎng)液的空白組。造模前PNS組根據藥物濃度梯度給藥2 h;缺氧前PNS組和A/R組分別更換為含/不含藥物的無血清培養(yǎng)液;缺氧6 h后,更換為含/不含藥物的正常培養(yǎng)液,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h;2 h后每孔加入10 μL CCK-8,培養(yǎng)1 h,于酶標儀波長450 nm處檢測OD值,計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(模型組OD值-空白組OD值)÷(正常組OD值-空白組OD值)×100%。

    1.5 細胞損傷率檢測

    根據LDH試劑盒說明書配制工作液。造模完成后,每孔加100 μL工作液,用鋁箔紙包裹96孔板,避光室溫反應30 min;反應結束后每孔加50 μL終止液,并于酶標儀波長490 nm處檢測OD值,計算細胞損傷率。細胞損傷率(%)=(模型組OD值-空白組OD值)÷(正常組OD值-空白組OD值)×100%。

    1.6 細胞自噬熒光檢測

    將細胞按2×105個/皿鋪于激光共聚焦專用皿中,培養(yǎng)24 h;依次使用1 μmol/L紅色熒光(DAPRed)和0.5 μmol/L綠色熒光(DALGreen)在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min[10];隨后進行A/R造模,最后在相同條件下使用激光共聚焦顯微鏡進行熒光圖片拍攝。自噬體被DAPRed染色,自噬溶酶體被DALGreen染色。根據紅綠熒光強度判斷細胞自噬體、自噬溶酶體數(shù)量和自噬流的變化。

    1.7 Western blot檢測

    造模結束后收集細胞,RIPA裂解液裂解細胞,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,取上清得細胞總蛋白;BCA法檢測蛋白濃度。蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳,轉膜,5%BSA封閉1 h,加入稀釋的一抗,4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h,ECL發(fā)光試劑顯影蛋白條帶,Image J軟件測定蛋白條帶灰度值。

    1.8 統(tǒng)計學方法

    2 結果

    2.1 三七總皂苷對模型細胞存活率及損傷率的影響

    與正常組比較,A/R組H9c2細胞存活率明顯降低(<0.05),細胞損傷率明顯升高(<0.05);與A/R組比較,PNS濃度為100、200 μg/mL時,H9c2細胞存活率明顯升高(<0.05);PNS濃度為50、100、200 μg/mL時,H9c2細胞損傷率明顯降低(<0.05)。見圖1、圖2。綜合細胞存活率及損傷率結果可以看出,濃度為100 μg/mL PNS減輕A/R損傷效果最顯著。

    注:與正常組比較,*P<0.05;與A/R組比較,#P<0.05

    注:與正常組比較,*P<0.05;與A/R組比較,#P<0.05

    2.2 三七總皂苷對模型細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達的影響

    與正常組比較,A/R組H9c2細胞p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義(>0.05);與A/R組比較,PNS預處理后,H9c2細胞p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(<0.05),見圖3。

    注:A.正常組;B. A/R組;C. A/R+PNS組;與A/R組比較;#P<0.05

    2.3 三七總皂苷對模型細胞自噬相關蛋白表達的影響

    與正常組比較,A/R組H9c2細胞Atg5、Beclin-1蛋白表達明顯升高,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著增加(<0.05),p62蛋白表達無明顯變化;與A/R組比較,A/R+PNS組H9c2細胞自噬相關蛋白Atg5、Beclin-1表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著降低(<0.05),p62蛋白表達明顯升高(<0.05),見圖4。表明PNS對自噬有明顯抑制作用,且可能抑制自噬流,其作用與自噬抑制劑HCQ和3-MA一致。此外,A/R+PNS+Rapa組H9c2細胞Atg5、Beclin-1蛋白表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯低于A/R+Rapa組,提示PNS逆轉了Rapa增強自噬的作用。

    2.4 三七總皂苷對模型細胞自噬流的影響

    使用自噬熒光染料標記H9c2細胞,DAPRed代表自噬體,DALGreen代表自噬溶酶體。結果顯示,正常組DAPRed和DALGreen熒光強度較弱,表明此時自噬程度較低。經A/R造模后各組DAPRed和DALGreen熒光強度均明顯增強,見圖5a,表明A/R后自噬增強。結果顯示,A/R組和A/R+Rapa組DAPRed和DALGreen熒光強度明顯增強(<0.05),表明自噬流水平顯著增加;與A/R組比較,A/R+PNS組和A/R+3-MA組DAPRed熒光強度明顯降低(<0.05),見圖5b,表明此時自噬體形成較少,但PNS無3-MA作用強。A/R+PNS組和A/R+HCQ組DALGreen熒光強度明顯低于A/R組(<0.05),見圖5c,表明此時自噬溶酶體數(shù)量減少,其可能與前期對自噬體生成抑制有關;也可能是PNS與HCQ作用效果一致,即對自噬溶酶體形成產生抑制作用。此外,A/R+PNS+Rapa組DALGreen熒光強度明顯低于A/R+Rapa組(<0.05),表明PNS可能通過抑制自噬溶酶體形成逆轉Rapa的作用。綜合自噬蛋白表達與熒光結果發(fā)現(xiàn),PNS可通過抑制自噬體及自噬溶酶體的形成抑制自噬流。

    A.正常組;B. A/R組;C. A/R+PNS組;D. A/R+PNS+Rapa組;E. A/R+Rapa組;F. A/R+HCQ組;G. A/R+3-MA組;與正常組比較,*P<0.05;與A/R組比較,#P<0.05;與A/R+Rapa組比較,▲P<0.05

    注:A.正常組;B. A/R組;C. A/R+PNS組;D. A/R+PNS+Rapa組;E. A/R+Rapa組;F. A/R+HCQ組;G. A/R+3-MA組;與正常組比較,*P<0.05;與A/R組比較,#P<0.05;與A/R+Rapa組比較,▲P<0.05

    3 討論

    心肌缺血再灌注可引起心肌細胞損傷甚至死亡,表現(xiàn)為心功能下降、心律失常等。本研究采用H9c2細胞制備A/R模型,模擬在體心肌缺血/再灌注模型,觀察PNS對A/R損傷細胞的影響。本實驗結果顯示,A/R后H9c2細胞存活率明顯下降,100、200 μg/mL PNS處理后細胞存活率明顯升高。除細胞活力檢測外,細胞培養(yǎng)液LDH含量檢測也能部分反映細胞損傷情況。LDH在細胞受損或死亡時被釋放到細胞外環(huán)境。本實驗中,不同濃度PNS處理細胞后,其培養(yǎng)液中LDH含量呈劑量依賴性降低,且濃度為50、100、200 μg/mL時較A/R組差異有統(tǒng)計學意義,表明此濃度PNS對H9c2細胞A/R損傷有一定的改善作用。

    現(xiàn)有研究表明,PI3K/Akt/mTOR信號通路可能因損傷、氧化應激等刺激而被激活[11],是保護心肌減輕MIRI的有效手段之一。此外,PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活與自噬的發(fā)生密切相關[12]。當發(fā)生MIRI時,PI3K被激活并可上調自噬的關鍵調節(jié)因子,包括Akt,PI3K可磷酸化Akt的Thr308和Ser473位點使Akt活化[13-14],而活化的Akt可磷酸化mTOR[15]。mTOR是細胞生長和代謝的關鍵調節(jié)劑,其mTORC1亞型也是自噬過程中發(fā)揮調節(jié)作用的上游活性因子之一[16]。磷酸化的mTOR可通過PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制由局部缺血誘導的瞬時自噬,從而降低MIRI[17-18]。本實驗結果表明,A/R組p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表達無明顯變化,PNS組p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表達顯著升高,表明PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活。

    為探討PNS能否通過PI3K/Akt/mTOR信號通路調控自噬,本研究進行了自噬相關實驗。心肌缺血時自噬增強,以清除受損的細胞器和細胞;再灌注時過高水平的自噬則加速心肌細胞死亡,導致MIRI[19]。自噬相關蛋白Atg5、Beclin-1表達水平可反映細胞自噬起始階段的變化情況[20-21]。LC3存在于自噬小體,同時也對自噬體形成具有重要作用[22],當自噬發(fā)生時,LC3Ⅰ大量轉化為LC3Ⅱ,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加[23]。本研究中,A/R組H9c2細胞Atg5、Beclin-1蛋白表達和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高,表明此時自噬水平上升;而PNS處理后H9c2細胞Atg5、Beclin-1表達和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯降低,表明PNS逆轉了A/R所致的自噬相關蛋白表達升高的趨勢,對自噬有一定的抑制作用。p62作為自噬下游階段的經典標志物之一,也可反映自噬的變化,其可與自噬體內膜上的泛素化底物和LC3結合,并通過在溶酶體系統(tǒng)中形成自噬溶酶體而被降解[24]。當自噬被抑制時,p62蛋白表達升高[25]。本研究結果顯示,PNS預處理后,H9c2細胞p62蛋白表達明顯升高,結合LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的變化,推測自噬體與溶酶體結合受阻,自噬流處于被抑制狀態(tài)。

    為探明PNS對自噬流的作用,我們通過自噬熒光檢測自噬體和自噬溶酶體的形成情況,觀察PNS對自噬流上下游環(huán)節(jié)的作用。細胞自噬熒光檢測試劑可觀察自噬流的整個過程,以DAPRed標記自噬體,其熒光強度較弱時,表明自噬體數(shù)量較少;以DALGreen標記自噬溶酶體,其熒光強度弱時,表明自噬溶酶體數(shù)量較少,其生成可能受阻或被過度降解。本實驗結果顯示,正常組DAPRed和DALGreen熒光強度較弱,表明自噬程度較低;A/R組H9c2細胞DAPRed和DALGreen熒光強度均明顯增強,表明A/R可顯著增強自噬流。與A/R組比較,A/R+PNS組和A/R+3-MA組DAPRed熒光強度明顯降低,表明PNS與3-MA作用相似,即可抑制自噬體形成和發(fā)展[26];由于PNS不能完全抑制自噬體的形成,因此使用自噬抑制劑HCQ,結果顯示,A/R+PNS組和A/R+HCQ組DALGreen熒光強度明顯降低,表明PNS與HCQ作用相似,可能抑制自噬溶酶體形成[27]。此外,A/R+PNS+Rapa組DALGreen熒光強度低于A/R+Rapa組,表明PNS可通過抑制自噬溶酶體發(fā)揮逆轉Rapa的作用。綜合自噬蛋白表達及熒光結果,表明PNS影響自噬流的上下游環(huán)節(jié),抑制自噬體及自噬溶酶體的形成,從而抑制自噬流。

    綜上,PNS可通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制自噬流,發(fā)揮對A/R H9c2細胞的保護作用,從而達到減輕MIRI保護心臟的作用。

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    Study on Panax Notoginseng Saponins Regulate Autophagy Against H9c2 Cells Anoxia/reoxygenation Injury via PI3K/Akt/mTOR Signaling Pathway

    WANG Piao, ZHENG Qing, HU Ting, ZHANG Haiyin, XU Yanwu, BAO Yimin

    To explore mechanism whether Panax notoginseng saponins (PNS) can regulate autophagy through the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway to reduce anoxia/reoxygenation (A/R) injury of H9c2 cells.H9c2 cells were divided into seven groups: control, anoxia-reoxygenation (A/R), A/R+PNS, A/R+PNS+ Rapamycin (Rapa), A/R+Rapa, A/R+hydroxychloroquine (HCQ), and A/R+3-methyladenine (3-MA). The A/R model of H9c2 cells was established by anoxia for 6 h and reoxygenation for 2 h. Cell survival rate was detected by CCk-8 method; cell damage was detected by LDH detection kit; autophagy-related proteins of Atg5, p62, Beclin-1, LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and PI3K/Akt/mTOR signaling pathway related proteins PI3K, Akt, mTOR expression were detected by Western blot; autophagy flow was observed by fluorescence.Compared with the control group, the cell viability of A/R group was decreased significantly while the cell damage rate was increased (<0.05). The expressions of autophagy-related proteins Atg5, Beclin-1 and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio were increased significantly (<0.05); The numbers of autophagosome and autolysosome increased significantly, and the level of autophagic flow increased significantly (<0.05). Compared with the A/R group, PNS preconditioning increased cell viability, reduced cell damage rate (<0.05); The expressions of Atg5, Beclin-1, and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio were reduced significantly (<0.05), and the expression of p62 was increased significantly, which were similar to the autophagy inhibitors HCQ and 3-MA; Autophagy fluorescence detection also revealed an inhibition of autophagic flow (<0.05). The expressions of p-PI3K, p-Akt and p-mTOR protein were increased after PNS preconditioning (<0.05).PNS can effectively reduce A/R damage in H9c2 cells, and its mechanism is related to the inhibition of autophagic flow by activating the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

    Panax notoginseng saponins; anoxia/reoxygenation injury; autophagy; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; H9c2 cells

    R285.5

    A

    1005-5304(2021)08-0087-06

    10.19879/j.cnki.1005-5304.202012070

    國家自然科學基金(81303256)

    包怡敏,E-mail:yiminbao@163.com

    (收稿日期:2020-12-04)

    (修回日期:2021-01-05;編輯:華強)

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