應(yīng)用高通量測序分析常溫貯藏吳山貢鵝的細(xì)菌多樣性

朱東喜 鄧潔瑩 王志琦 汪洋 李沛軍 徐寶才

摘 要：運(yùn)用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合高通量測序技術(shù)對常溫貯藏吳山貢鵝的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，研究吳山貢鵝微生物群落的變化以及導(dǎo)致吳山貢鵝腐敗的微生物分布。結(jié)果表明：吳山貢鵝貯藏期間pH值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，菌落總數(shù)則呈現(xiàn)上升的趨勢，貯藏末期吳山貢鵝中菌落總數(shù)、乳酸菌、大腸桿菌和假單胞菌的數(shù)量分別達(dá)到5.76、5.21、2.13、2.96 （lg（CFU/g））;高通量測序分析表明，在門水平上，貯藏初期和中期，吳山貢鵝中的優(yōu)勢菌門均為變形菌門，其相對豐度分別達(dá)到88%（初期）和87%（中期），貯藏末期的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門，相對豐度84%，在屬水平上，吳山貢鵝貯藏初期和中期相對豐度最高的均為假單胞菌屬和根瘤菌屬，假單胞菌屬相對豐度分別達(dá)到25%（初期）和34%（中期），根瘤菌屬相對豐度分別達(dá)到25%（初期）和20%（中期），貯藏末期的優(yōu)勢菌屬為副梭菌屬（50%）和魏斯氏菌屬（31%）;同時(shí)，吳山貢鵝貯藏期間微生物的多樣性分析結(jié)果表明，貯藏末期微生物的多樣性與前期、中期有顯著性差異;對微生物基因功能進(jìn)行預(yù)測，得到吳山貢鵝貯藏初期、中期和末期的菌群功能基因相似，主要涉及包括氨基酸代謝和碳水化合物代謝在內(nèi)的代謝途徑等。

關(guān)鍵詞：吳山貢鵝;傳統(tǒng)培養(yǎng);高通量測序;微生物分布;優(yōu)勢腐敗微生物

High-Throughput Sequencing Analysis of Bacterial Diversity in Wushan Marinated Goose Stored at Room Temperature

ZHU Dongxi， DENG Jieying， WANG Zhiqi， WANG Yang， LI Peijun， XU Baocai*

（China Light Industry Key Laboratory of Meat Microbial Control and Utilization， School of Food and Bioengineering，

Hefei University of Technology， Hefei 230009， China）

Abstract： In this study， traditional culture method combined with high-throughput sequencing was used to analyze the microbial community structure in Wushan marinated goose stored at room temperature. The aim was to study the change of the microbial community during the storage of Wushan marinated goose and the distribution of microorganisms that caused its spoilage. During storage， the pH of Wushan marinated goose presented a trend of rising firstly and then falling， and the total plate count exhibited a continuous upward trend. At the end of storage， the total plate count， and the numbers of lactic acid bacteria， Escherichia coli and Pseudomonas reached 5.76， 5.21， 2.13 and 2.96 （lg （CFU/g））， respectively. High-throughput sequencing showed that Proteobacteria was the dominant phylum at the early and middle stages of storage with relative abundance of 88% and 87%， respectively， while Firmicutes was dominant at the late stage with relative abundance of 84%. Pseudomonas and Rhizobium were the most abundant genera at the early and middle stages with relative abundance of 25% and 34% for Pseudomonas and of 25% and 20% for Rhizobium， respectively， whereas Paraclostridium （50%） and Weissella （31%） were the dominant bacteria at the late stage. The microbial diversity at the late stage of storage was significantly different from that at the early and middle stages. The gene function prediction of the microbial community indicated that the functional gene profiles at the three stages of storage were similar to each other， mainly involved in the amino acid metabolism and carbohydrate metabolism pathways.

Keywords： Wushan marinated goose; traditional culture method; high-throughput sequencing; microbial distribution; dominant spoilage organism

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210316-074

中圖分類號(hào)：TS251.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2021）04-0030-07

引文格式：

朱東喜， 鄧潔瑩， 王志琦， 等. 應(yīng)用高通量測序分析常溫貯藏吳山貢鵝的細(xì)菌多樣性[J]. 肉類研究， 2021， 35（4）： 30-36. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210316-074.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHU Dongxi， DENG Jieying， WANG Zhiqi， et al. High-throughput sequencing analysis of bacterial diversity in Wushan marinated goose stored at room temperature[J]. Meat Research， 2021， 35（4）： 30-36. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210316-074.

http：//www.rlyj.net.cn

鵝肉營養(yǎng)豐富，富含人體必需的多種營養(yǎng)物質(zhì)，并且脂肪含量很低，不飽和脂肪酸含量較高[1-2]，在2002年

被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為21世紀(jì)重點(diǎn)發(fā)展的綠色食品之一。中醫(yī)理論認(rèn)為，鵝肉味甘平，有補(bǔ)陰益氣、暖胃開津、祛風(fēng)濕、防衰老之效，是中醫(yī)食療的上品，對人體健康十分有益[3]。在國內(nèi)，鵝肉的市場比較小，現(xiàn)有的鵝肉產(chǎn)品通常只在本地銷售，包括風(fēng)干鵝、鹽水鵝、燒鵝等。吳山貢鵝作為安徽地區(qū)有名的徽菜，具有色清正、香濃郁、味鮮美等特點(diǎn)，深受消費(fèi)者的喜愛[4]。但是，由于吳山貢鵝多為未經(jīng)殺菌的即食產(chǎn)品，貯藏期很短，尤其在常溫貯藏的條件下極易腐敗變質(zhì)。因此，研究吳山貢鵝在常溫貯藏過程中的微生物多樣性是控制細(xì)菌繁殖、延長貨架期的基礎(chǔ)。

目前，國內(nèi)外對鵝肉貯藏期間的微生物多樣性研究較少。Kaban等[5]對干腌鵝的微生物特性和揮發(fā)性有機(jī)化合物進(jìn)行分析，結(jié)果表明，乳酸菌、微球菌和葡萄球菌是微生物群的重要組成部分且在一定程度上影響產(chǎn)品中揮發(fā)性有機(jī)化合物的形成。張曉春等[6]研究真空包裝后在14～16 ℃條件下貯藏0～4 d的榮昌鹵鵝中的菌相變化，得出榮昌鹵鵝貯藏后期腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢菌主要是腸桿菌與乳酸菌。另外，鄭玉璽等[7]研究不同溫度貯藏條件下導(dǎo)致廣式燒鵝腐敗變質(zhì)及新鮮度急劇下降的微生物，確定葡萄球菌屬、乳酸片球菌和芽孢桿菌屬為優(yōu)勢腐敗菌。以上研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對鵝肉中的微生物進(jìn)行分析研究，但是自然界中可以通過傳統(tǒng)培養(yǎng)分離獲得的微生物只占極少部分[8]，所以傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法在微生物群落和多樣性分析方面仍具有較大的局限性[9]。近年來，高通量技術(shù)在食品微生物群體特性的研究方面具有越來越廣闊的前景，相比傳統(tǒng)的微生物研究方法具有更高的通量、更高的分辨率及更快的速度等[10]，同時(shí)，近年來開始被應(yīng)用于各種肉類和及其產(chǎn)品中的微生物多樣性和種群動(dòng)態(tài)研究[11-12]，但是對醬鹵肉制品研究較少。

本研究以吳山貢鵝為研究對象，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)和高通量測序相結(jié)合的方法研究其在常溫貯藏下的細(xì)菌分布和多樣性的變化，確定常溫貯藏條件下的貨架期以及優(yōu)勢腐敗微生物，為后續(xù)醬鹵肉制品保鮮和抑菌技術(shù)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吳山貢鵝均采購于安徽省合肥市吳山貢鵝酒店管理公司。吳山貢鵝通常選用1 年左右的公皖西白鵝，采用秘制鹵水先大火煮熟再經(jīng)微火慢煮得到鵝肉成品。

乳酸菌選擇性培養(yǎng)基（MRS）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）、平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）、假單胞菌選擇性培養(yǎng)基（CFC） 青島海博生物有限公司;氯化鈉、氯化鉀、氧化鎂、硼酸、溴甲酚綠、甲基紅、瓊脂糖（均為化學(xué)純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）有限公司;十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）、引物、Phusion Master Mix（2×）、TAE電泳緩沖液

生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SevenCompact pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;RSD-250振蕩培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SCIENTZ-09無菌均質(zhì)器 寧波新芝生物科技股份有限公司;YX280手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

吳山貢鵝鹵制完成后1 h內(nèi)將其放入裝有融冰的保溫箱中運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，隨后進(jìn)行真空包裝，在室溫（20±2） ℃下貯藏，于貯藏0、12、24、36、48 h取樣測定各理化指標(biāo)。取貯藏時(shí)間為0、24、48 h的樣品分別記為ZM（初期）、FM（中期）和EM（末期），進(jìn)行高通量測序。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品均設(shè)3 個(gè)平行，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次（以數(shù)字編號(hào)1/2/3表示）。

1.3.2 pH值測定

按照GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品 pH測定》[13]的方法進(jìn)行測定。

1.3.3 微生物計(jì)數(shù)

菌落總數(shù)：采用GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[14]中的方法計(jì)數(shù);乳酸菌：采用GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》[15]中的方法計(jì)數(shù);大腸菌群：采用GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》[16]中的方法計(jì)數(shù);假單胞菌：參照張玉華等[17]的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.4 微生物總DNA的提取

采用CTAB法[18-19]提取細(xì)菌基因組DNA，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。取適量的DNA樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至

1 ng/?L。以上述稀釋后的DNA為模板，以515F（5-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3）和806R（GCCAATGGACTACHVGGGTWTCTAAT）為引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系（30 ?L）：Phusion Master Mix（2×）15 ?L、引物（2 ?mol/L）3 ?L、gDNA（基因組DNA）（1 ng/?L）10 ?L、H2O 2 ?L。

PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性1 min;98 ℃、10 s，50 ℃、30 s，72 ℃、30 s，30 個(gè)循環(huán);72 ℃、5 min。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣，充分混勻后使用1×TAE濃度2%的瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物，選擇主帶大小400～450 bp的序列，割膠回收目標(biāo)條帶。以Thermo Scientific公司GeneJET膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。Illumina Miseq高通量測序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.3.5 測序數(shù)據(jù)處理

首先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)（Clean Data），基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析。用Mothur方法與SILVA數(shù)據(jù)庫[20]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[21]

進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1.0），獲得分類學(xué)信息并分別在各分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成，使用MUSCLE軟件（Version 3.8.31，http：//www.drive5.com/muscle/）進(jìn)行快速多序列比對，得到所有OTUs序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系[22]。以數(shù)據(jù)量最少的樣本作為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行均一化處理，基于均一化處理后數(shù)據(jù)進(jìn)行Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析。使用QIIME軟件（Version 1.9.1）計(jì)算Chao1、Shannon、ACE指數(shù)和樣本覆蓋率。使用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線、等級(jí)聚類曲線和主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）圖，并進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析和PCoA。用QIIME軟件（Version 1.9.1）計(jì)算UniFrac距離，然后，利用OTUs的豐度信息對Unweighted UniFrac距離進(jìn)一步構(gòu)建Weighted UniFrac距離，用Weighted UniFrac距離和Unweighted UniFrac距離2 個(gè)指標(biāo)衡量2 個(gè)樣本間的相異系數(shù)。最后，通過基于最小16S rRNA序列相似度的最近鄰法實(shí)現(xiàn)Tax4Fun功能預(yù)測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

理化實(shí)驗(yàn)和微生物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)3 次平行實(shí)驗(yàn)后得到，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。SPSS 17.0和Microsoft Excel 2010軟件用于數(shù)據(jù)分析，使用GraphPad Prism 8.4.2軟件繪圖。使用單因素方差分析確定2 組數(shù)據(jù)的差異顯著性，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 吳山貢鵝貯藏過程中pH值和微生物數(shù)量變化

肉制品貯藏過程中由于微生物的分解代謝作用造成有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)的降解，監(jiān)測pH值的變化能夠表征肉制品的腐敗程度。由表1可知，吳山貢鵝貯藏過程中，pH值首先由6.21（0 h）顯著上升到6.46（24 h）（P<0.05），貯藏24～48 h，pH值略有下降，從6.46降低到6.12。貯藏前期升高的原因可能是氨基酸被分解為相應(yīng)的堿性物質(zhì)，而在貯藏后期可能是由于優(yōu)勢微生物（乳酸菌等）的生長與分解導(dǎo)致pH值降低。貯藏期間，吳山貢鵝的pH值呈先上升后下降的趨勢，此結(jié)果與常溫貯藏牛肉pH值的變化結(jié)果一致[23]。

貯藏0 h時(shí)，吳山貢鵝的菌落總數(shù)和乳酸菌數(shù)分別為3.38、3.20 （lg（CFU/g）），大腸桿菌未檢出（<2（1g（CFU/g）），表明新鮮吳山貢鵝菌落總數(shù)未超標(biāo)，符合安全標(biāo)準(zhǔn)。在整個(gè)貯藏期內(nèi)，菌落總數(shù)和乳酸菌總數(shù)皆呈現(xiàn)上升趨勢，貯藏48 h后，菌落總數(shù)和乳酸菌總數(shù)分別達(dá)到5.76、5.21 （1g（CFU/g）），已經(jīng)超過國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的菌落總數(shù)范圍（5 （1g（CFU/g）））[24]。

大腸桿菌在貯藏48 h時(shí)被檢出，達(dá)到2.13 （1g（CFU/g）），另外假單胞菌數(shù)在貯藏期也呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，在貯藏末期達(dá)到2.96 （1g（CFU/g））。這些結(jié)果表明，貯藏期間乳酸菌和假單胞菌存在于新鮮的吳山貢鵝中，隨著貯藏時(shí)間的延長其數(shù)量逐漸增長;至貯藏后期，乳酸菌數(shù)量最多，其次是假單胞菌，大腸桿菌最少。

2.2 高通量測序結(jié)果分析

2.2.1 細(xì)菌豐富性和多樣性分析

為了研究貯藏期間細(xì)菌豐富性和多樣性的變化，通過高通量測序分析得到Alpha多樣性指數(shù)。由表2可知，所有樣品的樣本覆蓋率至少為99%，這表明鵝肉樣品中幾乎所有細(xì)菌都可以被檢測到，增加測序數(shù)據(jù)已無法找到更多的OTU。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反映樣品微生物種群的豐富度，Shannon指數(shù)反映樣品微生物種群的多樣性，表現(xiàn)微生物種群的均勻度。高通量測序結(jié)果表明，吳山貢鵝中細(xì)菌的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)均在貯藏0 h時(shí)最低，分別為522.285、484.587和3.713。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)在貯藏24 h時(shí)最高，分別達(dá)到722.401和748.262，而Shannon指數(shù)在貯藏48 h最高，達(dá)到5.635。因此，常溫貯藏的吳山貢鵝在貯藏初期具有最低的微生物種類、多樣性和豐富性，而貯藏中期由于多種微生物共同競爭分解利用肉樣中的有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致其具有最高的豐富度。相對來說，貯藏末期吳山貢鵝中競爭力較強(qiáng)的微生物通過一系列拮抗或競爭作用，使自身產(chǎn)生更強(qiáng)的適應(yīng)性，從而占據(jù)主導(dǎo)地位，也導(dǎo)致了微生物種群豐富度的下降。

稀釋曲線主要反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣本中物種的豐富程度。由圖1A可知，當(dāng)序列數(shù)目>50 000時(shí)，曲線上各點(diǎn)的斜率均已趨于零，說明測序數(shù)據(jù)量漸趨合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種（OTUs）[25]。而等級(jí)聚類曲線可直觀反映樣本中物種的豐富度和均勻度，曲線越寬，樣品的物種豐富度越高，曲線越平滑，樣品的均勻度越大[26]。由圖1B可知，貯藏時(shí)間為48 h時(shí)曲線寬度最小，且最平滑。因此可以得出貯藏末期的樣品微生物物種豐富度最小，分布最均勻，這同樣表明了貯藏末期只有少數(shù)細(xì)菌占據(jù)主要地位且有強(qiáng)致腐能力，在吳山貢鵝腐敗過程中起到主要作用。

2.2.2 微生物分布

為了解貯藏期間微生物分布，通過高通量測序分析得到細(xì)菌在門和屬水平的相對豐度。由圖2A可知，在門水平上，貯藏初期和中期最主要的細(xì)菌為變形菌門（Proteobacteria），平均相對豐度分別約為88%和87%。而貯藏后期，厚壁菌門（Firmicutes）則占據(jù)主導(dǎo)，其次是變形菌門，平均相對豐度分別為84%和15%。由圖2B可知，在屬水平上，貯藏初期和中期假單胞菌屬（Pseudomonas）平均相對豐度約為25%和34%，而到貯藏末期則驟減到2%，假單胞菌是嚴(yán)格好氧微生物，在真空環(huán)境下生長會(huì)受到抑制，通常出現(xiàn)在生鮮肉及水產(chǎn)品貯藏過程中[27-29]。另外，在貯藏初期和中期還觀察到含量較高的未經(jīng)鑒定的根瘤菌（unidentified_Rhizobiaceae），分別占25%和20%，根瘤菌主要存在于土壤及環(huán)境中，在食品體系中相關(guān)研究很少[30]，所以鵝肉中出現(xiàn)這種細(xì)菌可能來自包裝前土壤或環(huán)境的污染。不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）在貯藏前、中期同樣相對豐度較高，分別達(dá)到20%和18%，它可利用氨基酸作為生長基質(zhì)產(chǎn)生酯、酸等物質(zhì)，在多種食品基質(zhì)中都有出現(xiàn)，包括泡菜、魚類、肉類等[31-34]。貯藏后期，優(yōu)勢菌門為厚壁菌門，平均相對豐度達(dá)到84%，在屬水平上，副梭菌屬（Paraclostridium）和魏斯氏菌屬（Weissella）占據(jù)主導(dǎo)地位，平均相對豐度分別為50%和31%。副梭菌是產(chǎn)芽孢的兼性厭氧菌，可以通過異型發(fā)酵產(chǎn)乳酸[35-36]，魏斯氏菌是兼性厭氧菌，會(huì)導(dǎo)致肉制品表面產(chǎn)生黏液、脹袋等感官劣變，是低溫肉制品特定的腐敗菌之一。

為了更清楚、直觀了解細(xì)菌在屬水平上的微生物分布，對所有樣本的種類和豐度進(jìn)行分析得到菌群分布熱圖。由圖3可知，在屬水平上，不同貯藏時(shí)期微生物差異性較大。unidentified_Ruminococcaceae、unidentified_Corynebacteriaceae、羅姆布茨菌（Romboutsia）等為貯藏初期相對豐度較高的菌屬，由于其多存在于環(huán)境、土壤及動(dòng)物腸道中[37-39]，食品體系較少出現(xiàn)，因此推測它們可能來源于加工污染。貯藏中期，優(yōu)勢菌則變?yōu)楦甑鞘暇℅ordonia）、短桿菌（Brevibacterium）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）等。貯藏末期，芽孢桿菌屬（Bacillus）、魏斯氏菌屬、副梭菌屬則生長迅速，占據(jù)主導(dǎo)地位。其中魏斯氏菌是真空包裝低溫肉制品中的特定腐敗菌之一，能導(dǎo)致產(chǎn)品黏液的產(chǎn)生[40-41]，吳山貢鵝在到達(dá)貯藏終點(diǎn)時(shí)，感官表現(xiàn)為表面有黏液產(chǎn)生，所以魏斯氏菌屬可能是導(dǎo)致這種現(xiàn)象的主要原因之一。同樣，芽孢桿菌也是肉制品中常見的腐敗菌，彭先杰等[42]發(fā)現(xiàn)，在37 ℃貯藏條件下腐敗的香辣仔鵝，其主要腐敗菌為枯草芽孢桿菌。李其軒等[43]的研究表明，肉粉腸在20 ℃條件下貯藏時(shí)，托盤包裝組的主要腐敗菌為貝萊斯芽孢桿菌。Wang Zhaoming等[44]研究得出，德州扒雞在84 ℃處理?xiàng)l件下貨架期結(jié)束時(shí)芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌是其主要腐敗菌。這些研究結(jié)果都與本研究的菌相結(jié)論相似，而且也說明不同肉制品中芽孢桿菌的種類可能存在差異。

2.2.3 微生物差異性分析

為比較不同貯藏期的菌群多樣性差異，對吳山貢鵝微生物進(jìn)行Beta多樣性分析。在PCoA圖中，各樣本點(diǎn)之間的距離可以代表樣本的差異大小，距離越近，差異越小。在Beta多樣性指數(shù)熱圖中，樣本的多樣性差異則通過2 個(gè)樣本之間的相異系數(shù)來表示，相異系數(shù)越小，差異則越小。

由圖4A可知，在PCoA圖中，ZM、FM和EM的樣本集中在不同區(qū)域，ZM和FM距離較近，ZM與EM以及FM與EM的距離較遠(yuǎn)。因此可以推斷出微生物多樣性在貯藏初期和中期差別較小，然而貯藏末期與貯藏初期和中期差異較大。由圖4B可知，在Beta多樣性指數(shù)熱圖中，EM與ZM和FM的相異系數(shù)都在0.5左右，而ZM和FM之間的相異系數(shù)在0.1左右。因此可以清楚地反映出貯藏后期的細(xì)菌多樣性與貯藏初期和中期的細(xì)菌多樣性有較大差距。綜合兩圖可得，在貯藏過程中細(xì)菌的多樣性是逐漸變化的，尤其到貯藏后期，細(xì)菌多樣性的變化非常顯著，通常表現(xiàn)為多樣性變小，物種變集中[45]。

2.2.4 細(xì)菌群落的功能預(yù)測

在不同貯藏時(shí)間吳山貢鵝核心菌群的多樣性和分布分析基礎(chǔ)上，預(yù)測整個(gè)貯藏期間微生物的基因功能。依據(jù)KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋，由圖5可知，通過與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對可以看出，吳山貢鵝貯藏過程中菌群高效表達(dá)的代謝通路中，與碳水化合物代謝、氨基酸代謝和能量代謝相關(guān)的通路最多，注釋基因比例分別達(dá)到1.93%、1.65%和0.79%。新陳代謝通路是微生物獲得營養(yǎng)進(jìn)行生長繁殖的主要代謝途徑，同時(shí)也是影響食品品質(zhì)和風(fēng)味的主要途徑。此外，涉及細(xì)菌細(xì)胞的膜運(yùn)輸、翻譯、復(fù)制和修復(fù)等的代謝通路也較多，可能是因?yàn)檫@些代謝通路與細(xì)菌的生長活動(dòng)有關(guān)。

對已注釋基因中的功能基因作進(jìn)一步分析，由圖6可知，不同貯藏時(shí)間樣品，其預(yù)測的菌群功能基因相似，忽略未知功能基因后，主要存在與膜運(yùn)輸、碳水化合物代謝、復(fù)制和修復(fù)、氨基酸代謝及翻譯相關(guān)的功能基因。其中的碳水化合物代謝和氨基酸代謝與腐敗有較密切的聯(lián)系，這些代謝活動(dòng)主要來源于貯藏期間大量存在的乳酸菌、芽孢桿菌等細(xì)菌。尤其對于乳酸菌，它可以通過碳水化合物代謝和氨基酸代謝降低pH值[46]，產(chǎn)生異味[47]，從而導(dǎo)致產(chǎn)品的品質(zhì)劣變。

3 結(jié) 論

通過傳統(tǒng)培養(yǎng)與高通量測序相結(jié)合的方式研究吳山貢鵝常溫貯藏期間的優(yōu)勢腐敗菌及微生物群落變化規(guī)律。結(jié)果表明：在貯藏期間，各種微生物數(shù)量均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，乳酸菌在貯藏末期占據(jù)主導(dǎo)地位，而菌落總數(shù)在貯藏48 h后超過國家標(biāo)準(zhǔn)熟肉微生物限量;此外，pH值則呈現(xiàn)總體下降的趨勢，可能是由于乳酸菌的大量生長繁殖使pH值降低;由Illumina MiSeq高通量測序結(jié)果結(jié)合Alpha和Beta多樣性指數(shù)可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，微生物群落多樣性發(fā)生了較大變化，貯藏初期和中期最主要的細(xì)菌為假單胞菌、根瘤菌及不動(dòng)桿菌，到貯藏后期則變?yōu)楦彼缶?、魏斯氏菌屬和芽孢桿菌屬，均具有較強(qiáng)的代謝能力，從而更有利于對肉的分解利用。由于不動(dòng)桿菌和根瘤菌多出現(xiàn)在環(huán)境中，因此貯藏初期存在這2 種細(xì)菌可能是由于生產(chǎn)加工環(huán)境的污染，所以企業(yè)在生產(chǎn)過程中應(yīng)當(dāng)提高衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，減少環(huán)境污染。本研究揭示了吳山貢鵝在常溫貯藏期間細(xì)菌群落的演替，為吳山貢鵝相應(yīng)抑菌保鮮方法的研究提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 唐霄， 孫楊贏， 江雪婷， 等. 不同蛋白酶制備鵝肉呈味肽的對比分析[J].

食品科學(xué)， 2019， 40（22）： 141-146. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20181023-272.

[2] ORKUSZ A， HARAF G， OKRUSZEK A， et al. Lipid oxidation and color changes of goose meat stored under vacuum and modified atmosphere conditions[J]. Poultry Science， 2016， 96（3）： 731-737. DOI：10.3382/ps/pew325.

[3] 陳藏器. 《本草拾遺》輯釋[M]. 尚志鈞輯釋. 合肥： 安徽科學(xué)技術(shù)出版社， 2002.

[4] 付蕭逸， 熊國遠(yuǎn)， 謝亮， 等. 吳山貢鵝在鹵制過程中的肉品質(zhì)變化規(guī)律研究[J]. 肉類工業(yè)， 2018（3）： 15-20.

[5] KABAN G， KZLKAYA P， BREKI B S， et al. Microbiological properties and volatile compounds of salted-dried goose[J]. Poultry Science， 2020， 99（4）： 2293-2299. DOI：10.1016/j.psj.2019.11.057.

[6] 張曉春， 李星， 解華東， 等. 鹵鵝貯藏過程中菌相變化研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊， 2019（11）： 61-63. DOI：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2019.11.017.

[7] 鄭玉璽， 阮征， 韓明， 等. 不同保藏條件下廣式燒鵝新鮮度變化及優(yōu)勢腐敗菌的鑒定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， 45（29）： 68-71. DOI：10.13989/j.cnki.0517-6611.2017.29.021.

[8] HUGENHOLTZ P， GOEBELl B M， PACE N R. Impact of culture-independent studies on the emerging phylogenetic view of bacterial diversity[J]. Journal of Bacteriology， 1998， 180（24）： 4765-4774. DOI：10.1007/BF02672962.

[9] ANGEL A， SZCZESNY P， MAYO B， et al. Biodiversity in oscypek， a traditional polish cheese， determined by culture-dependent and-

independent approaches[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2012， 78（6）： 1890-1898. DOI：10.1128/AEM.06081-11.

[10] PARK E J， CHUN J， CHA C J， et al. Bacterial community analysis during fermentation of ten representative kinds of kimchi with barcoded pyrosequencing[J]. Food Microbiology， 2012， 30（1）：

197-204. DOI：10.1016/j.fm.2011.10.011.

[11] JUAREZ-CASTELAN C， GARCIA-CANO I， ESCOBAR-ZEPEDA A，

et al. Evaluation of the bacterial diversity of Spanish-type chorizo during the ripening process using high-throughput sequencing and physicochemical characterization[J]. Meat Science， 2019， 150： 7-13. DOI：10.1016/j.meatsci.2018.09.001.

[12] PATTERSON M F， MCKAY A M， CONNOLLY M， et al. Effect of high pressure on the microbiological quality of cooked chicken during storage at normal and abuse refrigeration temperatures[J]. Food Microbiology， 2010， 27（2）： 266-273. DOI：10.1016/j.fm.2009.10.007.

[13] 中國商業(yè)聯(lián)合會(huì)商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中心， 國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（廣州）， 廣州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所. 肉與肉制品 pH測定： GB/T 9695.5—2008[S]. 北京： 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2008： 1-4.

[14] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)， 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定： GB 4789.2—2016[S]. 北京： 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2016： 1-4.

[15] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)， 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)：

GB 4789.35—2016[S]. 北京： 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2016： 1-6.

[16] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)， 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)： GB 4789.3—2016[S]. 北京： 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2016： 1-6.

[17] 張玉華， 孟一， 王順意， 等. 外源AHLs信號(hào)分子對假單胞菌（Pseudomonas）致腐能力的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2020， 46（18）： 78-84.

[18] STEWART C， VIA L E. A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications[J]. Biotechniques， 1993， 14（5）： 748-750.

[19] VIA L E， FALKINHAM III J O. Comparison of methods for isolation of Mycobacterium avium complex DNA for use in PCR and RAPD fingerprinting[J]. Journal of Microbiological Methods， 1995， 21（2）： 151-161. DOI：10.1016/0167-7012（94）00045-9.

[20] EDGAR R C. UPARSE： highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads[J]. Nature Methods， 2013， 10（10）： 996-998. DOI：10.1038/NMETH.2604.

[21] WANG Q， GARRITY G M， TIEDJE J M， et al. Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy[J]. Apply Environment Microbioloy， 2007， 73（16）： 5261-5267. DOI：10.1128/AEM.00062-07.

[22] QUAST C， PRUESSE E， YILMAZ P， et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project： improved data processing and web-based tools[J]. Nucleic Acids Research， 2012， 41（D1）： D590-D596. DOI：10.1093/nar/gks1219.

[23] MANSUR A R， SEO D H， SONG E J， et al. Identifying potential spoilage markers in beef stored in chilled air or vacuum packaging by HS-SPME-GC-TOF/MS coupled with multivariate analysis[J]. LWT-Food Science and Technology， 2019， 112： 108256. DOI：10.1016/j.lwt.2019.108256.

[24] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)， 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 熟肉制品： GB 2726—2016[S]. 北京： 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2016.

[25] 王偉， 冷凱良， 劉均忠， 等. 微生物擴(kuò)增子高通量測序技術(shù)在水產(chǎn)品加工與貯藏中的應(yīng)用[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2017， 43（10）： 263-268. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014760.

[26] CHAN F T， BRADIE J， BRISKI E， et al. Assessing introduction risk using species rank-abundance distributions[J]. Proceedings of the Royal Society B： Biological Sciences， 2015， 282： 1517. DOI：10.1098/rspb.2014.1517.

[27] NYCHAS G J E， SKANDAMIS P N， TASSOU C C， et al. Meat spoilage during distribution[J]. Meat Science， 2008， 78（1/2）： 77-89. DOI：10.1016/j.meatsci.2007.06.020.

[28] ERCOLINI D， FERROCINO I， NASI A， et al. Monitoring of microbial metabolites and bacterial diversity in beef stored under different packaging conditions[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2011， 77（20）： 7372-7381. DOI：10.1128/AEM.05521-11.

[29] ZHANG Jingbin， LI Yan， LIU Xiaochang， et al. Characterization of the microbial composition and quality of lightly salted grass carp （Ctenopharyngodon idellus） fillets with vacuum or modified atmosphere packaging[J]. International Journal of Food Microbiology， 2018， 293： 87-93. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2018.12.022.

[30] 陳文峰. 根瘤菌系統(tǒng)學(xué)研究進(jìn)展與展望[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2016， 43（5）： 1095-1100. DOI：10.13344/j.microbiol.china.150994.

[31] 鄒毅輝， 黃紅宣， 蔡藝敏， 等. 基于高通量測序分析不同年份閩南腌制蘿卜干中細(xì)菌多樣性[J]. 中國釀造， 2020， 39（5）： 40-43. DOI：10.11882/j.issn.0254-5071.2020.05.008.

[32] 史云嬌， 劉芳， 孫芝蘭， 等. 藏羊肉中優(yōu)勢腐敗不動(dòng)桿菌的分離鑒定及其生物膜形成特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2019， 35（1）： 195-203. DOI：10.3969/j.issn.1000-4440.2019.01.028.

[33] 劉愛芳， 謝晶， 錢韻芳. 冷藏金槍魚優(yōu)勢腐敗菌致腐敗能力[J]. 食品科學(xué)， 2018， 39（3）： 7-14. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201803002.

[34] BEKAERT K， DEVRIESE L， MAES S， et al. Characterization of the dominant bacterial communities during storage of Norway lobster and Norway lobster tails （Nephrops norvegicus） based on 16S rDNA analysis by PCR-DGGE[J]. Food Microbiology， 2015， 46： 132-138. DOI：10.1016/j.fm.2014.06.022.

[35] CHEN Y S， YANAGIDA F， SHINOHARA T. Isolation and identification of lactic acid bacteria from soil using an enrichment procedure[J]. Letters in Applied Microbiology， 2005， 40（3）： 195-200. DOI：10.1111/j.1472-765X.2005.01653.x.

[36] LEJA K， MYSZKA K， CZACZYK K. The ability of Clostridium bifermentans strains to lactic acid biosynthesis in various environmental conditions[J]. Springer Plus， 2013， 2（1）： 1-8. DOI：10.1186/2193-1801-2-44.

[37] KORSAK N， TAMINIAU B， HUPPERTS C， et al. Assessment of bacterial superficial contamination in classical or ritually slaughtered cattle using metagenetics and microbiological analysis[J]. International Journal of Food Microbiology， 2017， 247： 79-86. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2016.10.013.

[38] BORTOLUZZI C， SCAPINI L B， RIBEIRO M V， et al. Effects of β-mannanase supplementation on the intestinal microbiota composition of broiler chickens challenged with a coccidiosis vaccine[J]. Livestock Science， 2019， 228： 187-194. DOI：10.1016/j.livsci.2019.09.001.

[39] HUANG Kai， YU Wenwen， LI Sen， et al. Effect of embryo-remaining oat rice on the lipid profile and intestinal microbiota in high-fat diet fed rats[J]. Food Research International， 2019， 129： 108816. DOI：10.1016/j.foodres.2019.108816.

[40] CHENOLL E， MACI?N M， ELIZAQU?VEL P， et al. Lactic acid bacteria associated with vacuum-packed cooked meat product spoilage： population analysis by rDNA-based methods[J]. Journal of Applied Microbiology， 2010， 102（2）： 498-508. DOI：10.1111/j.1365-2672.2006.03081.x.

[41] KAMENIK J， DUSKOVA M， ?EDO O， et al. Lactic acid bacteria in hot smoked dry sausage （non-fermented salami）： thermal resistance of Weissella viridescens strains isolated from hot smoked dry sausages[J]. LWT-Food Science and Technology， 2015， 61（2）：

492-495. DOI：10.1016/j.lwt.2014.12.012.

[42] 彭先杰， 陳崇艷， 袁玉梅， 等. 香辣仔鵝特定腐敗菌的分離及鑒定[J]. 中國調(diào)味品， 2020， 45（7）： 39-43. DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2020.07.010.

[43] 李其軒， 陳倩， 王浩， 等. 不同包裝方式對高水分含量肉粉腸微生物菌群及品質(zhì)特性的影響[J]. 食品科學(xué)， 2021， 42（5）： 237-245. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20200309-142.

[44] WANG Zhaoming， SHI Yuzhu， ZHOU Kai， et al. Effects of different thermal temperatures on the shelf life and microbial diversity of Dezhou-braised chicken[J]. Food Research International， 2020， 136： 109471. DOI：10.1016/j.foodres.2020.109471.

[45] LI Ning， ZHANG Youxiong， WU Qingping， et al. High-throughput sequencing analysis of bacterial community composition and quality characteristics in refrigerated pork during storage[J]. Food Microbiology， 2019， 83： 86-94. DOI：10.1016/j.fm.2019.04.013.

[46] 湯敏， 黃俊逸， 李聰， 等. 冷藏過程中不同包裝德州扒雞的微生物及理化特性[J]. 食品科技， 2020， 45（6）： 122-129.

[47] 楊嘯吟， 張一敏， 梁榮蓉， 等. 包裝冷卻肉中微生物腐敗及其揮發(fā)性氣味的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)， 2021， 42（1）： 285-293. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20200207-046.