綠色魏斯氏菌發(fā)酵液對單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑制及其在冷卻豬肉保鮮中的應(yīng)用

楊超 于濤 姜曉冰

摘 要：采用微量肉湯稀釋法測定綠色魏斯氏菌（Weissella viridescens）發(fā)酵液對單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）的最小抑菌濃度，微孔板法結(jié)合顯微鏡觀察檢測綠色魏斯氏菌發(fā)酵液對Lm生物被膜形成的影響，最后通過測定冷藏過程中冷卻豬肉的菌落總數(shù)、Lm總數(shù)、感官指標(biāo)和理化指標(biāo)評估綠色魏斯氏菌發(fā)酵液對冷卻豬肉產(chǎn)品特性的影響。結(jié)果表明：綠色魏斯氏菌發(fā)酵液可抑制Lm的生長，亞抑菌濃度的發(fā)酵液能有效抑制Lm生物被膜的形成;綠色魏斯氏菌發(fā)酵液能夠抑制冷藏期間冷卻豬肉中細(xì)菌和Lm的生長，延緩冷卻豬肉因腐敗導(dǎo)致的感官品質(zhì)下降，同時(shí)對貯藏過程中冷卻豬肉pH值升高和揮發(fā)性鹽基氮含量的增加也具有抑制作用，使冷卻豬肉的貨架期明顯延長。

關(guān)鍵詞：單核細(xì)胞增生李斯特菌;綠色魏斯氏菌;發(fā)酵液;生物被膜;冷卻肉

Inhibition of Weissella viridescens Fermentation Broth on Listeria monocytogenes and Its

Application in Chilled Pork Preservation

YANG Chao1， YU Tao2， JIANG Xiaobing3，*

（1. Department of Tourist Management， Xinxiang Vocational and Technical College， Xinxiang 453003， China;

2. School of Life Sciences and Basic Medicine， Xinxiang University， Xinxiang 453003， China;

3. College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， China）

Abstract： The minimum inhibitory concentration （MIC） of the fermentation broth of Weissella viridescens against Listeria monocytogenes was determined using the broth microdilution method. And its effect on L. monocytogenes biofilm formation was investigated by microtiter plate assay and microscopic observation. By measuring the numbers of total colony and L. monocytogenes， sensory characteristics and physicochemical properties， the effect of the fermentation broth on the preservation of chilled pork was investigated. Our results showed that the fermentation broth of W. viridescens could inhibit the growth of L. monocytogenes， and biofilm formation of L. monocytogenes was inhibited by it at sub-inhibitory concentrations. The fermentation broth could inhibit the growth of total bacteria and L. monocytogenes in chilled pork， delay the decline in sensory quality caused by spoilage bacteria， and inhibit the increase in pH and total volatile basic nitrogen （TVB-N） value， thereby prolonging the shelf life of chilled pork.

Keywords： Listeria monocytogenes; Weissella viridescens; fermentation broth; biofilm; chilled meat

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210323-079

中圖分類號：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）04-0051-06

引文格式：

楊超， 于濤， 姜曉冰. 綠色魏斯氏菌發(fā)酵液對單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑制及其在冷卻豬肉保鮮中的應(yīng)用[J]. 肉類

研究， 2021， 35（4）： 51-56. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210323-079.? ? http：//www.rlyj.net.cn

YANG Chao， YU Tao， JIANG Xiaobing. Inhibition of Weissella viridescens fermentation broth on Listeria monocytogenes and its application in chilled pork preservation[J]. Meat Research， 2021， 35（4）： 51-56. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210323-079.? ? http：//www.rlyj.net.cn

肉類富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)及人體必需的微量元素，是人們膳食結(jié)構(gòu)中重要的組成部分。目前市售的生鮮肉按照所處溫度狀況可分為熱鮮肉、冷凍肉和冷卻肉[1]。近年來，隨著消費(fèi)者對食品安全和質(zhì)量的重視，我國肉類消費(fèi)呈現(xiàn)出從冷凍肉、熱鮮肉到冷卻肉的發(fā)展趨勢，冷卻肉市場發(fā)展?jié)摿κ志薮骩2]。冷卻肉是指對嚴(yán)格執(zhí)行檢疫制度屠宰后的畜胴體迅速進(jìn)行冷卻處理，使胴體溫度在24 h內(nèi)降到0～4 ℃，并在后續(xù)加工、流通和零售過程中環(huán)境溫度始終保持在0～4 ℃范圍內(nèi)的鮮肉。冷卻肉克服了熱鮮肉、冷凍肉在品質(zhì)上存在的不足和缺陷，因始終處于冷鏈控制下，微生物的生長受到抑制，因此冷卻肉的安全性較高;此外，冷卻肉經(jīng)歷了充分的解僵成熟過程，肉質(zhì)細(xì)嫩，滋味鮮美，營養(yǎng)價(jià)值高[3]。

盡管冷藏可以有效延長肉的保質(zhì)期，但是一些嗜冷細(xì)菌如單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）

仍能在冷藏條件下生長并引起冷卻肉腐敗變質(zhì)[4]。Lm是一種重要的食源性致病菌，能引起人畜共患傳染病李斯特菌病[5-7]。Lm對環(huán)境的耐受能力很強(qiáng)，可在低溫、高鹽等多種不利條件下生存[8-12]，還可以在食品及食品加工接觸面上形成生物膜，嚴(yán)重威脅食品安全[13-16]。

防腐保鮮劑的添加可以有效抑制細(xì)菌生長，延長冷卻肉的貨架期。常見的保鮮劑可以分為化學(xué)保鮮劑和生物保鮮劑，其中生物保鮮劑具有無毒、無害、無污染等優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)代保鮮技術(shù)的發(fā)展方向[17]。研究表明，微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物具有良好的抑菌活性，在食品防腐保鮮方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[18-22]。

本實(shí)驗(yàn)室從泡菜中分離出一株綠色魏斯氏菌（Weissella viridescens），考察綠色魏斯氏菌發(fā)酵液對Lm的抑菌效果以及對Lm生物膜形成的影響，通過測定冷藏過程中冷卻豬肉的菌落總數(shù)、Lm總數(shù)、感官和理化指標(biāo)，評估該發(fā)酵液對冷卻豬肉產(chǎn)品特性的影響，從而為冷卻肉生物保鮮劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷卻豬后腿瘦肉購于新鄉(xiāng)市某超市。

Lm 10403S菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存;綠色魏斯氏菌WV20-15分離自泡菜。

培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物技術(shù)有限公司;草酸銨 北京化工廠有限責(zé)任公司;結(jié)晶紫 天津市大茂化學(xué)試劑廠;無水乙醇（分析純） 天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CT15RE型離心機(jī) 日本日立公司;LGJ-25C冷凍干燥機(jī) 四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司;Bioscreen Cpro全自動生長曲線分析儀 芬蘭Oy Growth Curves Ab有限公司;DMi1倒置顯微鏡 德國Leica公司;

拍擊式均質(zhì)器 上海本昂科學(xué)儀器有限公司;

PHS-3B型pH計(jì) 上海雷磁電子儀器有限公司;Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 綠色魏斯氏菌發(fā)酵液的制備

將綠色魏斯氏菌WV20-15接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r/min下離心10 min，收集的發(fā)酵上清液再經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，濾液即為發(fā)酵原液。發(fā)酵原液經(jīng)真空冷凍干燥后稱質(zhì)量，并置于-20 ℃保存，使用時(shí)重新溶解于無菌水中配制成所需質(zhì)量濃度。

1.3.2 綠色魏斯氏菌發(fā)酵液對Lm的最小抑菌質(zhì)量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測定

采用微量肉湯稀釋法測定綠色魏斯氏菌發(fā)酵液對Lm的MIC。將發(fā)酵液冷凍干燥物重新溶解于無菌水中，配制成240、120、60、30、15 mg/mL的溶液。在96 孔板中依次加入不同質(zhì)量濃度的發(fā)酵液，然后加入稀釋后的Lm菌懸液，密封后置于37 ℃培養(yǎng)24 h。設(shè)置僅腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基的陰性對照以及僅Lm菌懸液的陽性對照，實(shí)驗(yàn)組和對照組均設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。以孔內(nèi)完全抑制Lm生長的最低質(zhì)量濃度為MIC。

1.3.3 Lm生長曲線測定

利用微生物全自動生長曲線分析儀測定Lm在綠色魏斯氏菌發(fā)酵液作用下的生長曲線[23]。挑取5 個(gè)單克隆菌落接種至BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)物按體積比1∶100分別接種至新鮮（對照組）和含有1/2 MIC發(fā)酵液的BHI培養(yǎng)基中，然后再轉(zhuǎn)移至100 孔蜂窩板中，37 ℃培養(yǎng)30 h，每隔15 min測定菌液的OD600 nm值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600 nm為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.3.4 綠色魏斯氏菌發(fā)酵液對Lm生物膜形成的影響

參照Djordjevic等[24]的方法，將Lm菌株培養(yǎng)至對數(shù)期早期（OD600 nm值約為0.4），分別使用含有1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC發(fā)酵液的BHI培養(yǎng)基稀釋Lm菌液至105 CFU/mL;以不含發(fā)酵液BHI培養(yǎng)基稀釋Lm菌液作為對照組。取200 μL稀釋菌液加至96 孔板中，37 ℃培養(yǎng)48 h后，小心棄去孔中的培養(yǎng)基，經(jīng)草酸銨結(jié)晶紫溶液染色、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液脫色后，用酶標(biāo)儀于595 nm波長處檢測其OD595 nm，同時(shí)置于倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.3.5 綠色魏斯氏菌發(fā)酵液在冷卻豬肉保鮮中的應(yīng)用

1.3.5.1 原料肉的處理

用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液充分擦拭刀具、案板等器具并紫外線照射15 min。在無菌條件下將新鮮豬肉腿肉切分成25 g左右的小塊。將肉塊隨機(jī)分成6 組，每組6 個(gè)平行，每個(gè)平行重復(fù)3 次。各組處理方法見表1。將處理好的樣品在4 ℃下冷藏，分別在冷藏0、3、6、9、12、15 d測定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.5.2 冷卻豬肉微生物指標(biāo)測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》對未接種組、2×MIC未接種組、4×MIC未接種組樣品中的細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行測定。取接種組、2×MIC接種組、4×MIC接種組樣品，在不同貯藏時(shí)期用BHI培養(yǎng)基進(jìn)行Lm計(jì)數(shù)。

1.3.5.3 冷卻豬肉感官質(zhì)量評定

由10 人組成感官評價(jià)小組，參照NY/T 632—2002《冷卻豬肉》對色澤、組織狀態(tài)、氣味和煮沸后肉湯4 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行感官評價(jià)，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。同時(shí)采用9 點(diǎn)評分法進(jìn)行評分：9 分=極好，8 分=很好，7 分=好，6 分=次好，5 分=一般，4 分=一般以下，3 分=差，2 分=很差，1 分=極差。

1.3.5.4 冷卻豬肉理化指標(biāo)測定

pH值：將25 g樣品研磨后加入225 mL蒸餾水，過濾，取濾液用pH計(jì)測定pH值，每個(gè)樣品測3 次，取平均值。揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic-nitrogen，TVB-N）含量：采用紫外分光光度計(jì)法測定，冷卻肉TVB-N含量超過20 mg/100 g即為變質(zhì)肉[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，利用SPSS 19.0軟件采用雙尾t檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，P<0.05被認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠色魏斯氏菌發(fā)酵液對Lm的MIC

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，Lm 10403S在含有15 mg/mL綠色魏斯氏菌發(fā)酵液的培養(yǎng)基中可以生長;當(dāng)綠色魏斯氏菌發(fā)酵液質(zhì)量濃度為30 mg/mL時(shí)，Lm 10403S的生長完全受到抑制。這表明綠色魏斯氏菌發(fā)酵液對Lm 10403S的生長具有抑制作用，其對Lm 10403S的MIC為30 mg/mL。

2.2 Lm菌株生長曲線測定結(jié)果

綠色魏斯氏菌發(fā)酵液質(zhì)量濃度過高時(shí)會抑制Lm 10403S菌株的生長，從而降低菌株生物被膜的形成量。為排除后續(xù)研究中細(xì)菌數(shù)量變化對生物被膜形成的干擾作用，本研究首先考察菌株Lm 10403S在亞抑菌濃度發(fā)酵液作用下的生長情況。由圖1可知，與對照組相比，加入1/2 MIC發(fā)酵液后菌株Lm 10403S的生長幾乎沒有受到影響。因此，該質(zhì)量濃度以及小于該質(zhì)量濃度的綠色魏斯氏菌發(fā)酵液可用于后續(xù)生物被膜的檢測實(shí)驗(yàn)。

2.3 Lm菌株生物被膜檢測結(jié)果

根據(jù)生長曲線的測定結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究在質(zhì)量濃度1/2 MIC、1/4 MIC和1/8 MIC綠色魏斯氏菌發(fā)酵液作用下菌株Lm 10403S的生物被膜形成能力。由圖2可知，與對照組相比，加入綠色魏斯氏菌發(fā)酵液后Lm 10403S的生物被膜形成量顯著降低（P<0.05），當(dāng)綠色魏斯氏菌發(fā)酵液質(zhì)量濃度分別為1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC時(shí)，Lm 10403S的生物被膜形成量分別下降了22.3%、28.1%和43.3%。

由圖3可知，未經(jīng)綠色魏斯氏菌發(fā)酵液處理的Lm 10403S細(xì)胞形成的網(wǎng)鏈狀生物被膜結(jié)構(gòu)致密、孔隙小;而在綠色魏斯氏菌發(fā)酵液作用下Lm 10403S細(xì)胞形成的生物被膜結(jié)構(gòu)疏松、空隙較大，且隨著發(fā)酵液質(zhì)量濃度的增加這種變化趨勢更明顯。

Lm在一定條件下可形成生物被膜，與浮游狀態(tài)相比，處于生物被膜中的Lm對消毒劑等殺菌物質(zhì)具有更強(qiáng)的抵抗能力，導(dǎo)致食品工業(yè)中常用的消毒程序很難將Lm生物被膜清除[25-26]。因此，有效控制Lm生物被膜的形成對保障食品安全具有重要意義。研究表明，某些細(xì)菌代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸、過氧化氫、細(xì)菌素等對Lm生物被膜的形成具有抑制作用[27-29]。Shao Xinhao等[29]報(bào)道一株腸膜明串珠菌的無細(xì)胞培養(yǎng)上清液對2 株Lm生物被膜的形成具有明顯抑制效果。宋杏等[30]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌Y42的無細(xì)胞培養(yǎng)上清液可抑制Lm生物被膜的形成及運(yùn)動性。

綠色魏斯氏菌為革蘭氏陽性菌，屬于異型發(fā)酵乳酸菌，廣泛分布于發(fā)酵食品中，如泡菜、臘腸、豆豉等。綠色魏斯氏菌不僅參與食品發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的形成，還具有潛在的抑菌特性。李文等[31]發(fā)現(xiàn)綠色魏斯氏菌ZY-6的發(fā)酵上清液能抑制大腸桿菌、沙門氏菌等常見食源性致病菌的生長。劉梅等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)條件下產(chǎn)細(xì)菌素綠色魏斯氏菌C1對Lm生長、毒力基因表達(dá)以及細(xì)胞黏附性均具有抑制作用。這些研究表明綠色魏斯氏菌及其代謝產(chǎn)物在食品腐敗菌和致病菌的防控方面具有應(yīng)用潛力。本研究中綠色魏斯氏菌WV20-15的發(fā)酵液不僅能夠抑制Lm的生長，對Lm生物被膜的形成也具有明顯抑制作用，然而發(fā)酵液中具體何種物質(zhì)在發(fā)揮作用尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

2.4 綠色魏斯氏菌發(fā)酵液對冷卻豬肉保鮮效果評價(jià)

2.4.1 綠色魏斯氏菌發(fā)酵液對冷卻豬肉中細(xì)菌生長的影響

冷卻肉的腐敗主要是由于細(xì)菌的大量繁殖導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解，因此冷卻肉中細(xì)菌的生長情況是判斷其新鮮度的依據(jù)之一[19]。由圖4A可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，未接種組和綠色魏斯氏菌發(fā)酵液處理組（2×MIC未接種組和4×MIC未接種組）中冷卻豬肉樣品的細(xì)菌總數(shù)均呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，但是綠色魏斯氏菌發(fā)酵液處理組的細(xì)菌總數(shù)增長速率均低于未接種組。冷藏6 d時(shí)，未接種組細(xì)菌總數(shù)已達(dá)107 CFU/g，2×MIC未接種組的細(xì)菌總數(shù)接近106 CFU/g，而4×MIC未接種組的細(xì)菌總數(shù)約為

105 CFU/g，較未接種組低2 個(gè)數(shù)量級;冷藏12 d時(shí)，2×MIC未接種組細(xì)菌總數(shù)超過107 CFU/g;冷藏15 d時(shí)，4×MIC未接種組的細(xì)菌總數(shù)超過107 CFU/g。由此可見，綠色魏斯氏菌發(fā)酵液能夠抑制冷卻豬肉中細(xì)菌的生長，延長冷卻豬肉的保質(zhì)期。

Lm在冷藏溫度下仍能生長繁殖，是引起冷卻肉腐敗變質(zhì)的主要菌種[18]。由圖4B可知，接種組和綠色魏斯氏菌發(fā)酵液處理組（2×MIC接種組和4×MIC接種組）中Lm總數(shù)均隨貯藏時(shí)間的延長而逐漸上升。相同貯藏時(shí)間內(nèi)，綠色魏斯氏菌發(fā)酵液處理組Lm總數(shù)均低于接種組，表明綠色魏斯氏菌發(fā)酵液能夠抑制冷卻豬肉中Lm的生長。

2.4.2 綠色魏斯氏菌發(fā)酵液對冷卻豬肉感官品質(zhì)的影響

由表3可知，貯藏期間綠色魏斯氏菌發(fā)酵液處理組（2×MIC未接種組和4×MIC未接種組）的總體感官評分始終高于未接種組。本實(shí)驗(yàn)以感官評分6 分作為冷卻肉貨架期終點(diǎn)，未接種組的貨架期不超過9 d，2×MIC未接種組的貨架期達(dá)9 d以上，而4×MIC未接種組的貨架期可達(dá)12 d，表明綠色魏斯氏菌發(fā)酵液能夠延長冷卻豬肉的貨架期。

2.4.3 綠色魏斯氏菌發(fā)酵液對冷卻豬肉理化性質(zhì)的影響

pH值可以反映肉的新鮮程度，一般認(rèn)為一級鮮肉的pH值為5.8～6.2，二級鮮肉的pH值為6.3～6.6，pH值大于6.7即為變質(zhì)肉[19]。由圖5可知，3 組冷卻豬肉的pH值變化均為先下降后上升。在貯藏初期（0～3 d），3 組冷卻豬肉的pH值均下降，這主要是由于肉樣組織細(xì)胞的呼吸作用使得肌肉中的肌糖原酵解和ATP分解產(chǎn)生乳酸、磷酸等酸性物質(zhì)所致[33]。隨著貯藏時(shí)間的延長，微生物開始大量繁殖，在肉中內(nèi)源蛋白酶和微生物分泌的蛋白水解酶作用下肌肉蛋白質(zhì)被分解為氨基酸、生物胺和氨等堿性物質(zhì)，從而使pH值上升[33]。未接種組在貯藏6 d時(shí)變質(zhì)，2×MIC未接種組貯藏12 d時(shí)為變質(zhì)肉，4×MIC未接種組貯藏15 d時(shí)為變質(zhì)肉。表明綠色魏斯氏菌發(fā)酵液能夠延緩pH值的升高，保持肉的新鮮度，適當(dāng)延長冷卻豬肉的貨架期。

TVB-N是指肉中的蛋白質(zhì)在酶和細(xì)菌的作用下分解產(chǎn)生的氨及胺類等堿性含氮物質(zhì)，其含量是反映肉鮮度的主要指標(biāo)。由圖6可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，3 組冷卻肉的TVB-N含量均逐漸增加。其中，未接種組上升較快，而4×MIC未接種組上升最慢。未接種組在貯藏6 d時(shí)開始變質(zhì)，2×MIC未接種組在貯藏9 d時(shí)達(dá)到變質(zhì)肉TVB-N含量，而4×MIC未接種組在貯藏12 d時(shí)變質(zhì)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)主要研究了綠色魏斯氏菌發(fā)酵液對Lm生長和生物被膜形成的影響，以及對冷卻豬肉冷藏期間品質(zhì)指標(biāo)變化的影響。結(jié)果表明，綠色魏斯氏菌發(fā)酵液可抑制Lm的生長，亞抑菌濃度的發(fā)酵液能有效抑制Lm生物被膜的形成，且這種抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性。綠色魏斯氏菌發(fā)酵液能夠抑制冷藏期間冷卻豬肉中細(xì)菌和Lm的生長，延緩冷卻豬肉因腐敗導(dǎo)致的感官品質(zhì)下降，同時(shí)對貯藏過程中冷卻豬肉pH值和TVB-N含量的增加也產(chǎn)生抑制作用，使冷卻豬肉的貨架期明顯延長。因此，綠色魏斯氏菌發(fā)酵液在冷卻豬肉防腐保鮮方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，有望開發(fā)成為新型生物保鮮劑。目前關(guān)于綠色魏斯氏菌發(fā)酵液的應(yīng)用仍有許多問題亟待解決，如綠色魏斯氏菌發(fā)酵液中有效成分的分離、純化和鑒定，以及有效成分的作用機(jī)制等。

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