APOB在肝癌中的表達(dá)及其預(yù)后價值的研究

彭秀蘭，田 山，雷長江，何安兵，羅仁峰，董衛(wèi)國

1.武漢市第五醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430050； 2.武漢市協(xié)和醫(yī)院感染科；3.武漢市第五醫(yī)院普外科； 4.江漢大學(xué)診斷教研室；5.武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科

肝癌是全球第六大惡性腫瘤，也是我國最常見的惡性腫瘤之一，中國最新癌癥報(bào)告顯示，肝癌的發(fā)病率為惡性腫瘤第4位，死亡率為腫瘤相關(guān)死亡第2位[1]。雖然近年來肝癌治療取得了很大的進(jìn)展，但手術(shù)仍然是原發(fā)性肝癌患者最佳治療方案。然而，肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高，預(yù)后情況仍然不能令人滿意[2]。因此，闡明肝癌的發(fā)病機(jī)制，找到經(jīng)濟(jì)、能夠預(yù)測患者預(yù)后的臨床和病理學(xué)指標(biāo)顯得尤為重要。

載脂蛋白主要包括載脂蛋白A1(Apolipoprotein A1，APOA1)和載脂蛋白B(Apolipoprotein B，APOB)，其在脂蛋白的代謝中發(fā)揮重要作用，可結(jié)合和運(yùn)輸血脂到各組織進(jìn)行代謝及利用、調(diào)節(jié)酶活性、引導(dǎo)血漿脂蛋白同細(xì)胞表面受體結(jié)合。在腫瘤細(xì)胞異常增生代謝的過程中，會使得脂質(zhì)代謝率提高，因此血脂和脂蛋白含量會相應(yīng)發(fā)生變化[3]。目前普遍認(rèn)為APOB是與肥胖和心血管疾病密切相關(guān)的基因，近年的研究發(fā)現(xiàn)APOB與多種癌癥的進(jìn)展及預(yù)后情況相關(guān)[4-6]?；艋巯技癓iu等[4-5]報(bào)道，APOB的基因多態(tài)性和血液中APOB的表達(dá)水平與乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)。Yan等[6]研究提示，血清中APOB的表達(dá)水平可預(yù)測肝癌患者術(shù)后生存情況，但APOB在肝癌發(fā)生與發(fā)展中的作用目前仍存在爭議。本研究首先分析癌癥基因圖譜(the Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫肝癌數(shù)據(jù)集中APOB mRNA的表達(dá)以及預(yù)后分析，利用cBioportal探究APOB基因突變與肝癌患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。此外，檢測血清APOB蛋白在肝癌組織和正常組織的表達(dá)水平并探究血清APOB蛋白對肝癌的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院于2015年8月至2018年8月收治的114例經(jīng)手術(shù)病理確診的肝細(xì)胞癌患者為肝癌組，選取同期來本院體檢中心進(jìn)行健康體檢的100名正常體檢者作為對照組。該項(xiàng)目的所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011 版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；(2)有完整的血清 APOB、APOA1和甘油三酯檢測值，其他血清學(xué)指標(biāo)盡可能詳細(xì)；(3)患者有準(zhǔn)確的病理診斷結(jié)果。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)肝癌復(fù)發(fā)或行二次手術(shù)的患者；(2)合并有其他惡性腫瘤的患者；(3)手術(shù)前接受放療或化療的患者；(4)進(jìn)行APOB檢測2周內(nèi)服用過降血脂藥物；(5)合并高脂血癥患者。

1.3 APOB的測定于患者術(shù)前半個月內(nèi)采用全自動生化分析儀進(jìn)行檢測。生化指標(biāo)異常判斷標(biāo)準(zhǔn)：參考《中國成人血脂異常防治指南(2016修訂版)》[7]，APOB正常值參考臨床檢驗(yàn)值范圍。

1.4 生物信息學(xué)分析

1.4.1 APOB基因在TCGA數(shù)據(jù)庫中表達(dá)分析：APOB mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)在TCGA數(shù)據(jù)庫中(https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)下載。收集資料包括患者年齡、性別、腫瘤組織學(xué)分級、腫瘤浸潤深度(T)分期、淋巴結(jié)(N)分期、轉(zhuǎn)移(M)分期、TNM分期、總生存期和無復(fù)發(fā)生存期肝癌數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)分析。運(yùn)用Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org)分析APOB mRNA 水平在肝癌組織與癌旁肝組織表達(dá)的差異性；利用Kaplan Meier Plotter在線網(wǎng)站(http://kmplot.com /analysis/)探究APOB mRNA在肝癌患者預(yù)后中的價值。

1.4.2 APOB基因突變與肝癌臨床特征分析：采用cBioportal分析工具(http://www.cbioportal.org/)對TCGA數(shù)據(jù)庫中APOB的基因改變頻率進(jìn)行分析，探究APOB基因突變與年齡、T分期和TNM分期的關(guān)聯(lián)，并作預(yù)后分析(總生存期和無復(fù)發(fā)生存期)。

2 結(jié)果

2.1 APOB mRNA 在肝癌組織與癌旁組織的表達(dá)水平及其診斷價值分析TCGA肝癌隊(duì)列中APOB表達(dá)情況，結(jié)果顯示，APOB mRNA在373例肝癌組織(16.60±0.085)中的表達(dá)顯著低于50例癌旁組織(17.83±0.062)(P< 0.001，見圖1A)。GEO數(shù)據(jù)庫GSE14520數(shù)據(jù)集中225例肝癌組織APOB mRNA水平(12.74±0.05)也低于220例癌旁組織(13.0±0.02)(P<0.0001，見圖1B)。以上結(jié)果證實(shí)APOB在肝癌組織中表達(dá)降低。TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中APOB mRNA可以作為診斷肝癌的標(biāo)志物(AUC=0.87，見圖1C)，當(dāng)最佳截?cái)嘀禐?7.58時，APOB mRNA對診斷肝癌的靈敏度為81.77%，特異度為80%。而對GSE14520的APOB mRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行ROC分析，結(jié)果表明APOB mRNA在GSE14520數(shù)據(jù)集中對肝癌也具有較好的診斷價值(AUC=0.64，見圖1D)，當(dāng)最佳截?cái)嘀禐?3.1時，APOB mRNA對診斷肝癌的靈敏度為63.11%，特異度為60% 。

注：A：TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中肝癌組織和癌旁組織APOB mRNA表達(dá)水平；B：GSE14520數(shù)據(jù)集中肝癌組織和癌旁組織APOB mRNA表達(dá)水平；C：TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中APOB mRNA對肝癌的診斷價值；D：GSE14520數(shù)據(jù)集中APOB mRNA對肝癌的診斷價值

2.2 APOB mRNA與肝癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性及患者預(yù)后分析對影響APOB mRNA的臨床病理因素分析結(jié)果顯示，病毒性肝炎(P=0.046)、T分期(P=0.018)、G分期(P=0.02)和TNM分期(P=0.024)能夠影響APOB mRNA的表達(dá)(見圖2)。進(jìn)一步分析APOB mRNA的表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)性，結(jié)果顯示，高表達(dá)APOB mRNA的肝癌患者總生存期長于低表達(dá)APOB mRNA的患者(HR=0.5，95%CI: 0.35～0.7,P<0.0001，見圖3A)，高表達(dá)APOB mRNA的肝癌患者無復(fù)發(fā)生存期長于低表達(dá)APOB mRNA患者(HR=0.62, 95%CI:0.44～0.89，P=0.0076，見圖3B)。

圖2 APOB mRNA與肝癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析

圖3 APOB mRNA水平與肝癌患者預(yù)后分析 A：高表達(dá)APOB mRNA的肝癌患者總體生存期長于低表達(dá)APOB mRNA的患者；B：高表達(dá)APOB mRNA的肝癌患者無復(fù)發(fā)生存期長于低表達(dá)APOB mRNA的患者

2.3 APOB基因突變與肝癌患者臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性通過cBioportal網(wǎng)站分析APOB基因突變顯示，355例肝癌患者有47例發(fā)生基因突變，總體基因突變率為13.24%，變異10.42%(37例)，擴(kuò)增2.25%(8例)，深度缺失0.28%(1例)，多位點(diǎn)突變0.28%(1例)(見圖4A)。APOB基因突變的患者年齡低于未突變的肝癌患者(P=0.004，見圖4B)，突變的肝癌患者T分期晚于未突變的患者(P=0.0148，見圖4C)，突變的肝癌患者TNM分期晚于未突變的患者(P=0.0206，見圖4D)。預(yù)后分析表明，無APOB基因突變的患者總生存期長于突變的患者(P=0.0778，見圖5A)，且無APOB基因突變的患者無復(fù)發(fā)生存期長于突變的患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖5B)，可能與突變組例數(shù)較少有關(guān)。

圖4 APOB基因突變與臨床特征的相關(guān)性 A：13.24%的肝癌患者存在APOB基因位點(diǎn)的突變；B：APOB基因突變的患者年齡低于未突變的肝癌患者；C：突變的肝癌患者T分期晚于未突變的患者；D：突變的肝癌患者TNM分期晚于未突變的患者

圖5 APOB基因突變與肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性 A：無APOB基因突變的患者總生存期長于突變的患者；B：無APOB基因突變的患者無復(fù)發(fā)生存期優(yōu)于突變的患者

2.4 APOB 蛋白在肝癌患者與正常體檢者的表達(dá)水平及其鑒別診斷價值114例肝癌患者和100名健康體檢者血清中APOB蛋白表達(dá)水平分析結(jié)果表明，肝癌患者APOB蛋白水平顯著低于健康體檢者[(0.77±0.02)g/Lvs(0.86±0.022)g/L，P=0.0049，Cut-off<0.805，靈敏度=62.28%，特異度=61.00%，見圖6A]，血清中APOB蛋白對診斷肝癌具有一定的價值(AUC=0.60，見圖6B)。APOB的表達(dá)與與腫瘤分化程度(P=0.021)、AFP表達(dá)水平相關(guān)(P=0.029，見表1)。

表1 APOB蛋白表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性

圖6 APOB 蛋白在肝癌與健康體檢者的表達(dá)水平及其鑒別診斷價值 A：肝癌患者APOB蛋白水平顯著低于健康體檢者；B：APOB蛋白對肝癌的診斷價值

3 討論

研究顯示，血清APOA1是肝癌患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，且低水平的APOA1與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，血清中APOB/APOA-I比值升高是結(jié)直腸癌預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測因素[8-9]。血清中APOB水平與肥胖、心血管疾病、高脂蛋白血癥、脂肪吸收不良、眼科疾病、惡性腫瘤等密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，肝癌組患者APOB mRNA表達(dá)和血清APOB蛋白水平明顯降低，提示肝癌患者脂蛋白含量存在異常。

Lee等[10]的基因組數(shù)據(jù)分析表明，APOB可能在調(diào)節(jié)參與肝癌發(fā)生發(fā)展的多種基因中發(fā)揮重要的作用，使用siRNA沉默表達(dá)肝癌細(xì)胞中的APOB后癌細(xì)胞增殖與侵襲能力顯著加強(qiáng)，提示APOB的沉默表達(dá)與肝癌患者不良的臨床結(jié)果和癌細(xì)胞的增殖情況顯著相關(guān)。Yan等[6]報(bào)道，血清APOB水平較低的患者術(shù)后中位生存時間較長(20.33個月vs11.16個月)，血清APOB水平是肝癌患者獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，且術(shù)前APOB水平較高的患者術(shù)后生存情況較差。李仲等[11]的研究表明，術(shù)前APOB≥0.90 g/L時，其平均生存期為936 d，顯著長于術(shù)前APOB<0.90 g/L患者(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的APOB水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，APOB為胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。石璟等[12]報(bào)道，乳腺癌患者血清中APOB明顯低于正常人，血清中高APOB水平可能是乳腺癌發(fā)生的保護(hù)因素。Lin等[13]表明，APOB不是肝癌發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果提示，肝癌組患者APOB mRNA表達(dá)和血清APOB蛋白水平明顯降低，APOB表達(dá)水平與腫瘤分化程度、AFP表達(dá)水平相關(guān)，APOB mRNA可以作為診斷肝癌的標(biāo)志物(AUC=0.87)且具有較好的診斷價值(AUC=0.64)，血清中APOB水平亦可作為肝癌的診斷標(biāo)志物。預(yù)后分析表明，高表達(dá)APOB mRNA的肝癌患者總生存期長于低表達(dá)APOB mRNA的患者(HR=0.5，P<0.0001)，無復(fù)發(fā)生存期長于低表達(dá)APOB mRNA的患者(HR=0.62，P=0.0076)。

TCGA項(xiàng)目發(fā)現(xiàn)，肝癌突變基因圖譜中除了熟知的原癌基因和抑癌基因，白蛋白和APOB基因亦發(fā)生頻繁的突變，表明它們可能在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[14]。Schonfeld報(bào)道家族性低β脂蛋白血癥患者存在APOB的致病性基因突變，其血清中低密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇降低，且由APOB基因突變導(dǎo)致的家族性低β脂蛋白血癥患者更易發(fā)生脂肪肝、肝硬化和肝癌[15-16]。我們通過cBioportal分析APOB基因突變顯示，APOB基因突變的患者年齡低于未突變的肝癌患者(P=0.004)，T分期晚于未突變的患者(P=0.0148，)，TNM分期晚于未突變的患者(P=0.0206)。預(yù)后分析顯示，無APOB基因突變的患者總體生存期長于突變的患者(P=0.0778)，兩者之間無復(fù)發(fā)生存期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們推測APOB基因突變與肝癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后相關(guān)，存在突變的患者臨床病理學(xué)特征和預(yù)后較差。

APOB基因是一肥胖相關(guān)基因，位于人2號染色體短臂上，全長43 kb，由29個外顯子和28個內(nèi)含子組成，參與體內(nèi)脂質(zhì)的代謝，是低密度脂蛋白的主要蛋白質(zhì)成分[17]。APOB基因主要特異性表達(dá)在人類的肝臟和小腸組織，肝臟合成APOB100，小腸產(chǎn)生APOB48，然而APOB48脂蛋白從血漿中快速清除，不轉(zhuǎn)化為低密度脂蛋白，因此常用APOB表示血清中APOB100[18]。APOB與甘油三酯、膽固醇、磷脂蛋白共同生成極低密度脂蛋白顆粒。極低密度脂蛋白從肝臟分泌后，脂蛋白脂肪酶將脂蛋白中的甘油三酯水解生成中間密度脂蛋白，最終生成低密度脂蛋白顆粒。低密度脂蛋白通過在其表面APOB與低密度脂蛋白受體結(jié)合，而APOB則分解為肝臟中的氨基酸。APOB在肝臟中合成并在肝臟中降解，血清中APOB的含量不僅與肝臟合成速度有關(guān)，而且與降解速度有關(guān)，本研究結(jié)果與Yan等[6]的報(bào)道不一致，推測可能與除肝癌組織外，殘余的肝功能還可能影響肝癌患者的預(yù)后有關(guān)，尚需進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

綜上所述，肝癌患者癌組織APOB mRNA和血清APOB水平異常，且與患者的臨床病理學(xué)特征和預(yù)后有關(guān)。檢測肝癌患者血清APOB水平有助于預(yù)測患者的預(yù)后。