DACT2、PITX2在結(jié)腸癌、腺瘤組織中的表達(dá)及意義

牛昊書(shū)， 陳 吉， 侯羽菲

1.內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.青島西海岸區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科

近年來(lái)，結(jié)腸癌在我國(guó)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，Muto等[1]在1974年揭示結(jié)腸腺瘤是結(jié)腸黏膜癌變過(guò)程中的一個(gè)階段，隨后Fearon等[2]證實(shí)了“結(jié)腸腺瘤—結(jié)腸癌”的發(fā)展順序，證明大部分發(fā)生惡變的結(jié)腸黏膜組織在早期階段可能是腺瘤。位于染色體6q27上的β-環(huán)連蛋白抑制基因2(dishevelled-binding antagonist of beta-catenin 2，DACT2)[3]作為腫瘤抑制基因得到了廣泛的關(guān)注，其通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)在結(jié)腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要功能[4]。配對(duì)樣同源轉(zhuǎn)錄因子2(paired-like homedomain transcription factor 2，PITX2)位于染色體4q25-27上，首先在垂體中被發(fā)現(xiàn)，是涉及幾種器官和組織及早期胚胎發(fā)育所需要的一種轉(zhuǎn)錄因子[5]。PITX2是位于Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶標(biāo)基因之一，參與調(diào)控多種癌基因的表達(dá)，該通路的激活可能會(huì)引起機(jī)體中PITX2的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而使癌基因表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化和遷移呈現(xiàn)異常狀態(tài)，最終發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生和侵襲的作用[6-7]。本研究旨在探討DACT2和PITX2在結(jié)腸黏膜癌變過(guò)程中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取在2018年12月至2019年10月就診于內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院消化內(nèi)科行結(jié)腸鏡檢查的患者，收集鏡下表現(xiàn)聯(lián)合病理診斷為正常結(jié)腸黏膜30名，結(jié)腸腺瘤30例，結(jié)腸癌30例。排除標(biāo)準(zhǔn)：家族性腺瘤性息肉病史；既往或現(xiàn)在患其他系統(tǒng)惡性腫瘤；內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病史；既往或現(xiàn)為炎癥性腸病者。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)最終病理結(jié)果進(jìn)行分組：正常對(duì)照組30名，男13名，女17名，年齡(54.70±10.25)歲，結(jié)腸腺瘤組30例，男16例，女14例，年齡(55.90±11.18)歲，結(jié)腸腺癌組30例，男18例，女12例，年齡(59.36±9.09)歲。各組患者的性別及年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 主要試劑與儀器：Trizol(美國(guó)Ambion)，HiScript Reverse Transcriptase(諾唯贊)，SYBR Green Master Mix(Invitrogen)，PCR引物(Invitrogen)，電子結(jié)腸鏡(奧林巴斯)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific)，微量分光光度計(jì)(奧盛公司)。

1.3.2 標(biāo)本的采集與存放：所有患者在進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查前完成術(shù)前談話，簽署知情同意書(shū)，在患者行結(jié)腸鏡檢查或治療時(shí)，取得活檢標(biāo)本。將鏡下取得的新鮮標(biāo)本放入凍存管中，保存在超低溫冰箱中(-80 ℃)。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)DACT2和PITX2基因mRNA的表達(dá)：將樣本迅速移至勻漿管，加入1 ml的Trizol裂解液，將勻漿器調(diào)至6 500 r/min，震動(dòng)15 s，裂解10 min，將200 μl氯仿加入混合液中，搖晃后置于室溫中5 min，然后將其轉(zhuǎn)入離心管中，4 ℃ 12 000 r/min,離心15 min(離心半徑8.5 cm)，得到上層水相加入400 μl異丙醇，于室溫中擱置10 min，再次4 ℃ 12 000 r/min,離心10 min(離心半徑8.5 cm)，將上清液遺棄，加入75%乙醇1 ml，再次4 ℃ 10 000 r/min離心5 min(離心半徑8.5 cm)，再次棄去上清液，將干燥的RNA溶于20 μl DEPC水中，從中分裝出2 μl測(cè)定核酸濃度，剩余RNA溶液-80 ℃保存。去除總RNA中的基因組DNA冰上配制反應(yīng)混合液。反轉(zhuǎn)錄需要按照一定條件進(jìn)行，反應(yīng)條件為:25 ℃，5 min，50 ℃，15 min，85 ℃，5 min，4 ℃，10 min。制備完成后暫時(shí)不用者可-20 ℃保存?zhèn)溆?。?jīng)過(guò)上述處理后最終獲得cDNA，qRT-PCR相對(duì)定量檢測(cè)可以以其為模板進(jìn)行，最終獲得DACT2和PITX2基因mRNA表達(dá)狀況。

2 結(jié)果

2.1 DACT2 mRNA在正常結(jié)腸黏膜組、結(jié)腸腺瘤組、結(jié)腸癌組中的表達(dá)DACT2 mRNA在三組中的表達(dá)呈逐漸降低趨勢(shì)，在正常對(duì)照組中表達(dá)最高，在結(jié)腸癌組中表達(dá)量最低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，三組組間比較，結(jié)腸腺瘤組表達(dá)量低于正常結(jié)腸黏膜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，結(jié)腸癌組低于結(jié)腸腺瘤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，結(jié)腸癌組與正常結(jié)腸黏膜組對(duì)比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(見(jiàn)表1)。

2.2 PITX2 mRNA在正常結(jié)腸黏膜組、結(jié)腸腺瘤組、結(jié)腸癌組中的表達(dá)PITX2 mRNA在結(jié)腸癌組中的表達(dá)量最高，正常對(duì)照組中表達(dá)量最低，呈逐漸上升趨勢(shì)，且三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，結(jié)腸腺瘤組相對(duì)表達(dá)量低于結(jié)腸癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，結(jié)腸腺瘤組表達(dá)量明顯高于正常結(jié)腸黏膜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(見(jiàn)表1)。

表1 DACT22與PITX2 mRNA在三組中表達(dá)的比較

2.3 DACT2與PITX2 mRNA在正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸癌中表達(dá)的相關(guān)性在正常結(jié)腸黏膜組，DACT2與PITX2 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.483，P<0.05)；在結(jié)腸腺瘤組，DACT2與PITX2 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.403，P<0.001)；在結(jié)腸癌組中DACT2與PITX2 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.733，P<0.001)(見(jiàn)圖1～3)。

圖1 DACT2與PITX2 mRNA在正常結(jié)腸黏膜組中表達(dá)的相關(guān)性

圖2 DACT2與PITX2 mRNA在結(jié)腸腺瘤組中表達(dá)的相關(guān)性

圖3 DACT2與PITX2 mRNA在結(jié)腸癌組中表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

結(jié)腸癌作為消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，已經(jīng)越來(lái)越多的被人們所熟知。近年，結(jié)腸癌在我國(guó)發(fā)病率每年呈遞增的趨勢(shì)。隨著內(nèi)鏡診治技術(shù)的不斷進(jìn)步,大幅度提高了結(jié)直腸息肉的檢出率,1/2～3/4的結(jié)直腸息肉為腺瘤性息肉[8]，其中約20%的腺瘤性息肉最終進(jìn)展為腺癌，早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)行內(nèi)鏡下切除可大幅降低結(jié)腸癌的發(fā)生率[9]。盡管對(duì)結(jié)腸黏膜惡變的研究較多，但機(jī)制仍未完全清楚，通過(guò)對(duì)結(jié)腸腺瘤癌變的分子生物學(xué)機(jī)制研究，將可能揭開(kāi)結(jié)腸腺瘤癌變機(jī)制的面紗并對(duì)結(jié)腸癌的早期診斷、預(yù)防及治療提供幫助。

在Wnt/β-catenin路徑中，各種原因引起β-catenin降解減少可使其在胞漿中不斷積聚，繼而致其細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)增加，致T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)共激活，進(jìn)而致下游靶基因激活。目前已知β-catenin的主要伴侶是TCF/LEF家族，在Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。Yu等[10]通過(guò)敲低胃癌細(xì)胞系中的DACT2，發(fā)現(xiàn)β-catenin和c-myc的表達(dá)增強(qiáng)，考慮為β-catenin磷酸化的水平降低致其降解減少，其向我們揭示了Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路可能被DACT2所抑制，從而抑制腫瘤進(jìn)展的機(jī)制。相關(guān)研究表明，TCF/LEF的家族成員淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子1(lymphoid enhancer factor-1，LEF1)以及β-catenin與DACT2有密切的關(guān)聯(lián)性，DACT2既能與β-catenin形成緊密聯(lián)結(jié)，又能與LEF1聯(lián)結(jié)，從而減少β-catenin-LEF1復(fù)合物在細(xì)胞核中的形成，干擾腫瘤中Wnt信號(hào)路徑的觸發(fā)，這是結(jié)直腸腺癌中DACT2抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路作用的重要機(jī)制[4]。Jia等[11]研究表明，肺癌細(xì)胞的增殖和分化可以通過(guò)DACT2干擾Wnt信號(hào)通路而受到抑制。在肺癌細(xì)胞中啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化與DACT2表達(dá)沉默密切相關(guān)，在經(jīng)過(guò)5-氮雜-2′-脫氧氮雜胞苷誘導(dǎo)后可使DACT2重新表達(dá)，說(shuō)明原發(fā)性肺癌中的啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化可使DACT2表達(dá)沉默。相關(guān)研究[12-13]表明，乳腺癌中DACT2甲基化頻率較高，Wnt路徑可因DACT2啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化沉默后發(fā)生激活，β-catenin降解減少至其胞漿中濃度升高進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核增多，使TCF/LEF激活，進(jìn)一步激活下游靶基因的表達(dá)從而促進(jìn)乳腺癌發(fā)生以及轉(zhuǎn)移，間接表明人乳腺癌細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路可被DACT2抑制而產(chǎn)生抑癌作用。Lu等[14]通過(guò)研究表明，DACT2與β-catenin直接聯(lián)結(jié)可抑制細(xì)胞核中β-catenin/LEF1復(fù)合物形成，最終抑制腫瘤發(fā)生、進(jìn)展。DACT2作為腫瘤抑制基因被研究證明是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)，侵襲和轉(zhuǎn)移目的。本研究結(jié)果表明，DACT2基因的mRNA在正常黏膜組、結(jié)腸腺瘤組、結(jié)腸腺癌組中的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸下降的趨向，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。據(jù)此可知，DACT2與結(jié)腸腺瘤癌變的過(guò)程呈負(fù)相關(guān)，DACT2 mRNA的含量在癌變過(guò)程中存在規(guī)律性的表達(dá)降低，當(dāng)DACT2 mRNA表達(dá)降低時(shí)腫瘤惡變傾向也繼之升高，推測(cè)DACT2在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑制作用，但仍需進(jìn)一步行基因敲除研究加以證實(shí)。今后或許可通過(guò)檢測(cè)DACT2的表達(dá)量來(lái)作為結(jié)直腸癌早期診斷的方法之一，通過(guò)影響DACT2的表達(dá)作為預(yù)防結(jié)直腸腺瘤癌變的手段之一，并為結(jié)直腸癌基因治療的靶點(diǎn)提供新的方向。

PITX2是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游效應(yīng)物之一，其作為轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤進(jìn)展中激活下游癌基因。相關(guān)研究[6，15-16]表明，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子C-myc和Cyclin D1可以通過(guò)上調(diào)PITX2的表達(dá)而增加，從而促使腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲增強(qiáng)。Aubele等[17]發(fā)現(xiàn),PITX2在乳腺癌中的表達(dá)增多，經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑中β-catenin可增強(qiáng)下游PITX2的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，進(jìn)而推導(dǎo)PITX2可能通過(guò)Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展。Huang[18]等在敲除了PITX2基因的體外培養(yǎng)的人甲狀腺癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子Cyclin D2的表達(dá)下調(diào)。提示甲狀腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能與β-catenin-PITX2通路、PITX2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)Cyclin D2表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。當(dāng)激活Wnt信號(hào)通路后，Wnt與細(xì)胞表面的多種蛋白受體結(jié)合成復(fù)合物使β-catenin與其蛋白形成復(fù)合物的過(guò)程受到抑制致游離β-catenin增多。另外的β-catenin難以被磷酸化和泛素化降解，其進(jìn)入細(xì)胞核后與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF聯(lián)結(jié)可以增強(qiáng)下游靶基因PITX2的表達(dá)。本研究結(jié)果提示，在正常結(jié)腸組、結(jié)腸瘤組、結(jié)腸癌組中PITX2 mRNA的表達(dá)水平呈逐步上升的趨勢(shì)。PITX2的表達(dá)水平與結(jié)腸腺瘤到結(jié)腸癌的過(guò)程呈正相關(guān)關(guān)系，PITX2基因的過(guò)度表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)結(jié)腸腺瘤癌變過(guò)程的發(fā)展。圍繞PITX2基因表達(dá)與結(jié)腸癌發(fā)生機(jī)制的研究可能會(huì)對(duì)結(jié)腸癌的早期診斷及治療提供新的思路和方法，這尚需進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路的經(jīng)典功能是通過(guò)增加細(xì)胞質(zhì)β-catenin的水平，增強(qiáng)β-catenin的核轉(zhuǎn)運(yùn)，充當(dāng)T細(xì)胞因子(T cell factor，TCF)的轉(zhuǎn)錄共激活因子，以增強(qiáng)下游靶基因的激活調(diào)控。Wnt通過(guò)觸發(fā)復(fù)雜的具有差異性的細(xì)胞表面胞內(nèi)段的活化信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)將細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，以調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、生長(zhǎng)及發(fā)育等。同時(shí)在腫瘤的發(fā)生中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活也起到了重要的作用[19]。本研究中，DACT2和PITX2基因mRNA的表達(dá)含量在正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸腺瘤及結(jié)腸癌組織中有顯著性差異，二者在結(jié)腸腺瘤癌變的過(guò)程中表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。上述結(jié)果表明，DACT2與PITX2可能分別在結(jié)腸正常上皮-腺瘤-結(jié)腸癌的演變過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用，結(jié)合既往研究，其機(jī)制可能為DACT2基因通過(guò)Wnt/β-catenin路徑調(diào)控下游PITX2基因的表達(dá)，PITX2為在結(jié)直腸腺瘤癌變中起促進(jìn)作用，DACT2作為上級(jí)調(diào)控位點(diǎn)通過(guò)抑制Wnt/β-catenin路徑間接抑制PITX2的表達(dá)，從而對(duì)結(jié)直腸腺瘤癌變過(guò)程起抑制作用，多種因素可能通過(guò)影響到DACT2的表達(dá)活性從而調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，但影響DACT2基因表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚。通過(guò)本研究結(jié)果，我們推測(cè)在結(jié)腸腺瘤癌變的過(guò)程中PITX2與DACT2分別發(fā)揮重要作用并可能相互影響，但其具體證據(jù)鏈尚不完整，二者在結(jié)直腸腺瘤癌變過(guò)程中的分子機(jī)制以及詳細(xì)的上下游作用機(jī)制尚不清晰，需進(jìn)一步行深入的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究加以論證。