JAM3 基因甲基化是胰腺癌的潛在診斷標(biāo)志物

呂紅慧， 張美英， 郭明洲

1.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001； 2.中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科醫(yī)學(xué)部

胰腺癌是一種惡性程度極高的惡性腫瘤，其5年生存率低于10%，隨著人口的老齡化，其發(fā)病率呈快速增長趨勢，預(yù)計(jì)到2030年將成為全球死亡第二位的惡性腫瘤[1-2]。在美國，胰腺癌的中位年齡是71歲，只有20%的胰腺癌發(fā)生在60歲之前，而發(fā)生在45.5歲之前的不足3%[3]。胰腺癌由于其特殊的解剖特征和早期癥狀不典型，80%～85%患者確診時(shí)已為晚期或已發(fā)生轉(zhuǎn)移而失去手術(shù)機(jī)會(huì)[4-5]。吸煙、飲酒、肥胖、慢性糖尿病、非素食等飲食因素和遺傳性因素是胰腺癌發(fā)生的高危因素[6-7]。與遺傳學(xué)改變相比，表觀遺傳更易受到環(huán)境因素的影響。過去的研究表明，表觀遺傳學(xué)的累積性改變在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[8-13]，因此，DNA甲基化有望成為胰腺癌早期診斷、預(yù)后、化療敏感性的標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

連接粘附分子(junctional adhesion molecules，JAM)是屬于免疫球蛋白超家族的糖蛋白，由兩個(gè)細(xì)胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜片段和一個(gè)可變長度的細(xì)胞質(zhì)尾部組成[14]。JAM與上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞連接相關(guān)，主要在白細(xì)胞、血小板和紅細(xì)胞表面分布。研究發(fā)現(xiàn)，JAM蛋白對各種細(xì)胞過程均很重要，包括白細(xì)胞遷移、血小板激活、血管生成和病毒的結(jié)合[15]。JAM3是JAM 家族中的一員，是上皮細(xì)胞之間建立緊密連接的主要成分[16]。JAM3在宮頸癌和上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)中均發(fā)生高甲基化，且甲基化可作為CIN預(yù)后的標(biāo)志物[17-18]。最近發(fā)現(xiàn)JAM3 在結(jié)腸癌中發(fā)生高甲基化，甲基化與腫瘤分期顯著相關(guān)，是一個(gè)新的抑癌基因[19]。JAM3已被證明與黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移相關(guān)，且JAM3與同家族成員JAM-B的相互作用促進(jìn)了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長和轉(zhuǎn)移[20-21]。JAM3在胰腺癌中的作用尚不明確。本研究對JAM3在胰腺癌中的甲基化情況及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 胰腺癌細(xì)胞系及組織標(biāo)本本實(shí)驗(yàn)所采用的胰腺癌細(xì)胞系Panc3.11、Panc1、SW1990、Miapaca2、Aspc1、Panc5.04、Panc10.05、CFpac1均為以前在原發(fā)胰腺癌中建立的細(xì)胞系，應(yīng)用90% RPMI 1640的培養(yǎng)基和質(zhì)量濃度為100 g/L的小牛血清，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。待細(xì)胞的融合度達(dá)到1/3時(shí)，向培養(yǎng)基中加入5-aza-dc使其終濃度為2 μmol/L，每24 h更換新的含有5-aza-dc的培養(yǎng)基，藥物作用96 h提取細(xì)胞RNA。本實(shí)驗(yàn)采用的79例胰腺癌組織和5例非癌患者的正常胰腺組織來源于中國人民解放軍總醫(yī)院。取材的所有患者術(shù)前均未接受任何放化療等治療，術(shù)后病理檢查均證實(shí)為原發(fā)胰腺癌。本研究獲得中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號：20090701-015)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞總RNA提取與半定量RT-PCR檢測：取對數(shù)生長期細(xì)胞，用Trizol Reagent提取總RNA后經(jīng)紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和質(zhì)量。取5 μg總RNA用Thermo Scientific RevertAid RT。試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，將20 μl cDNA用ddH2O稀釋至100 μl，然后取2.5 μl的cDNA模板在25 μl的反應(yīng)容積中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RT-PCR引物序列為：5′-CTGGAATGTGACACGGAGAGAC-3′(forward)和5′-CCTTCGGCACTCTACAGACAC-3′(reverse)，產(chǎn)物長度為140 bp，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，5 min；95 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s(3個(gè)循環(huán))；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s(3個(gè)循環(huán))；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s(3個(gè)循環(huán))；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s(26個(gè)循環(huán))；72 ℃ 7 min。ddH2O為陰性對照，排除體系污染。GAPDH為內(nèi)參檢測cDNA質(zhì)量，引物序列為： 5′-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3′(forward)和5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(reverse)，產(chǎn)物長度為454 bp，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s(25個(gè)循環(huán))；72 ℃ 7 min。取10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 DNA的提取和甲基化特異性PCR(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)：將對數(shù)生長期細(xì)胞消化離心后去除培養(yǎng)基，10%SDS加蛋白酶K進(jìn)行消化，酚氯仿法抽提DNA，乙醇沉淀然后溶于TE緩沖溶液儲(chǔ)存。取2 μg DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉硫化后用DNA clean up試劑盒純化溶于20 μl的ddH2O中于-80 ℃冰箱保存[22-23]。JAM3啟動(dòng)子區(qū)特異性甲基化引物序列為：(M-forward) 5′-TTATGGTGTCGGTTCGGTTGGGTTC-3′和(M-reverse)5′-AATTACTAAAAAACCAACGACAACGCG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為131 bp。啟動(dòng)子區(qū)特異性非甲基化引物序列為：(U-forward)5′-TTATTATGGTGTTGGTTTGGTTGGGTTT-3′和(U-reverse)5′-AAAAATTACTAAAAAACCAACAACAACACA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為137 bp。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s(35個(gè)循環(huán))；72 ℃ 7 min。體外甲基化DNA(in vitro methylated DNA，IVD)為甲基化陽性對照組，正常人外周血淋巴細(xì)胞DNA(normal lymphocyte DNA，NL)為非甲基化對照組，ddH2O為陰性對照組。取10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。JAM3啟動(dòng)子區(qū)甲基化率與胰腺癌患者相關(guān)因素的相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在胰腺癌細(xì)胞系中JAM3的表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的調(diào)控通過半定量的RT-PCR在人胰腺癌細(xì)胞系中檢測到JAM3的表達(dá)(見圖1A)。發(fā)現(xiàn)在Panc3.11、SW1990、Aspc1、Panc10.05細(xì)胞中JAM3缺失表達(dá)。在Panc1、Miapaca2、Panc5.04和CFpac1中檢測到JAM3的高水平表達(dá)。用MSP檢測JAM3啟動(dòng)子的DNA甲基化(見圖1B)。在JAM3表達(dá)完全缺失的Panc3.11、SW1990、Aspc1和Panc10.05細(xì)胞中，啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生了完全甲基化。而在JAM3高表達(dá)的Panc1、Miapaca2、Panc5.04和CFpac1細(xì)胞中，其啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)榉羌谆?。這些結(jié)果表明，JAM3表達(dá)缺失與人類胰腺癌細(xì)胞啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化相對應(yīng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證JAM3的表達(dá)是受啟動(dòng)子區(qū)甲基化的調(diào)控，應(yīng)用去甲基化試劑5-aza-dc處理胰腺癌細(xì)胞后，激活Panc3.11、SW1990、Aspc1和Panc10.05細(xì)胞JAM3的重新表達(dá)，而在Panc1、Miapaca2、Panc5.04和CFpac1細(xì)胞中處理前后均未發(fā)生表達(dá)變化(見圖1A)。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，JAM3的表達(dá)受到啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的調(diào)控。

注：-：細(xì)胞未經(jīng)過5-aza-dc處理,+：細(xì)胞經(jīng)過5-aza-dc處理；M：甲基化,U：非甲基化。

2.2 JAM3在胰腺癌組織中頻繁發(fā)生甲基化為探討JAM3在胰腺癌中的甲基化情況，應(yīng)用MSP方法檢測了79例原發(fā)人胰腺癌及5例非癌患者正常胰腺標(biāo)本。JAM3在胰腺癌組織中的甲基化率為48.1%(38/79)，而正常胰腺未發(fā)現(xiàn)甲基化(0/5)，排除了組織特異性甲基化的可能性(見圖2)。JAM3的甲基化與胰腺癌分化程度顯著相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置、神經(jīng)侵犯、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、吸煙、飲酒等因素?zé)o相關(guān)性(P均>0.05，見表1)。

表1 JAM3甲基化與胰腺癌臨床因素的關(guān)系

注：M：甲基化，U：非甲基化，PN：正常胰腺組織，PC：胰腺癌組織。

3 討論

約90%的胰腺癌起源于胰腺導(dǎo)管的上皮細(xì)胞。從癌前病變到導(dǎo)管腺癌的發(fā)展呈漸進(jìn)性過程，其整個(gè)發(fā)展過程可能需要10年以上[24-25]。腫瘤抑制基因啟動(dòng)子的 DNA 甲基化被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的主要表觀遺傳機(jī)制。APC、BRCA1和p16INK4a的基因啟動(dòng)子是人類胰腺腫瘤中最常見的甲基化基因[26]。胰腺癌中關(guān)鍵基因的表觀遺傳異常不僅可以作為其診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，也可能作為治療的靶標(biāo)[27-30]。JAM3是JAM家族中的一員,是表達(dá)于哺乳動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞上的緊密連接相關(guān)跨膜蛋白，在骨髓內(nèi)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的歸巢和動(dòng)員中發(fā)揮作用[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，JAM3在胰腺癌中的甲基化率為48.1%，且其表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)控，提示JAM3甲基化可作為胰腺癌診斷標(biāo)志物。JAM3甲基化與胰腺癌的分化程度相關(guān)，表明JAM3甲基化與胰腺癌的惡性程度相關(guān)。JAM3甲基化與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置、神經(jīng)侵犯、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、吸煙、飲酒無關(guān)，可能與檢測的樣本量較小相關(guān)，需要增加樣本量進(jìn)一步研究。不同基因的表觀遺傳異常，可能參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展和化療的敏感性。因此，深入研究表觀遺傳異常在胰腺癌中的作用機(jī)制，將為胰腺癌的分子靶向治療提供新策略，如DNA損傷修復(fù)機(jī)制和死亡機(jī)制等。