翼莖羊耳菊提取物對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7的抗炎作用

黃 春 麗， 吳 樂 昊， 于 洋， 金 慧 子， 張 巖

( 1.上海交通大學(xué) 藥學(xué)院， 上海 200240；2.上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 上海 200240 )

0 引 言

炎癥是機(jī)體對外界損傷產(chǎn)生的一種復(fù)雜的防御反應(yīng)，在保護(hù)機(jī)體、防御外來病原體的感染中發(fā)揮重要作用。一般認(rèn)為炎癥是一種有益的宿主防御系統(tǒng)，但是過度、失調(diào)的炎癥反應(yīng)就會有害。在失調(diào)的炎癥反應(yīng)中，復(fù)雜的炎癥介質(zhì)包括促進(jìn)炎癥的細(xì)胞因子和具有細(xì)胞毒性的細(xì)胞因子等會伴隨不同疾病的發(fā)生發(fā)展，包括肺炎[1]、關(guān)節(jié)炎[2]、慢性支氣管炎[3]、風(fēng)濕病[4]等，甚至包括一些神經(jīng)退行性疾病例如阿爾茨海默病[5]。近年來，各類炎癥性疾病發(fā)病率持續(xù)走高，且呈不斷上升趨勢，甚至已經(jīng)成為全球性疾病[6]，尋找并發(fā)現(xiàn)安全有效的治療炎癥性疾病的藥物的需求在不斷上升。

炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)理的重要特征即炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞是重要的固有免疫細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞，炎癥發(fā)生時，巨噬細(xì)胞被招募到炎癥部位，并被外界物質(zhì)刺激分泌產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，同時啟動細(xì)胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)[7]，產(chǎn)生炎癥。巨噬細(xì)胞被募集到炎癥部位釋放炎癥介質(zhì)，在機(jī)體的炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[8]，因此抑制炎癥介質(zhì)的釋放以及相關(guān)的信號通路的激活是緩解炎癥的重要手段。脂多糖(LPS)作為一種重要的內(nèi)毒素，可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥因子以及炎癥介質(zhì)，如：腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、一氧化氮(NO)等[9]。LPS誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，是評價藥物抗炎活性以及進(jìn)行機(jī)制研究的經(jīng)典細(xì)胞模型[10]。

翼莖羊耳菊是我國特有的藥用植物，在云南邊陲應(yīng)用廣泛，主要用作脈管炎的治療。在《滇藥錄》中記載，翼莖羊耳菊還可用于根治癰瘡腫毒，氣管炎，跌打損傷，氣虛頭昏等病癥[11]；而在《滇省志》中，其還可用于根治肺虛咳嗽等[12]。但目前對其化學(xué)成分和藥理作用尚知之甚少[13]。本研究采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，以期評價翼莖羊耳菊的抗炎活性并探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI1640培養(yǎng)基，Hyclone公司；胎牛血清，Gibco公司；二甲基亞砜、小白菊內(nèi)酯，Sigma公司；NO試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑，Thermo Fisher Scientific公司；TaKaRa試劑盒，東洋紡(上海)生物科技有限公司；SYBR Green qPCR試劑，DBI Bioscience公司；Anti-ERK抗體、Anti-P-ERK抗體、Anti-p65抗體、Anti-P-p65抗體、Anti-β-actin抗體、Anti-iNOS抗體、Anti-p38抗體、Anti-P-p38、Anti-Akt抗體、Anti-P-Akt抗體、Anti-JNK抗體、Anti-P-JNK抗體，Cell Signaling公司；ELISA試劑盒，Thermo Fisher Scientific公司、欣博盛。

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7，中國細(xì)胞系庫(北京)。

1.2 翼莖羊耳菊的提取

將干燥的翼莖羊耳菊(鑒定人：張君，云南昆明植分生物技術(shù)有限公司)全草粉碎后，用95%的乙醇進(jìn)行回流提取，獲得提取液，即為總提取物(ZT)；將總提取液在旋蒸儀上濃縮旋干，將獲得的旋干后固體用石油醚萃取，即為石油醚部位(PE)；將石油醚部位再用乙酸乙酯萃取，即獲得乙酸乙酯萃取液，進(jìn)一步旋干即為乙酸乙酯部位(EA)；將乙酸乙酯萃取液進(jìn)一步用正丁醇萃取，旋干即獲得正丁醇部位(n-BuOH)，剩余為水溶性組分(H2O)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 U/mL 鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，并放置在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.4 NO釋放實驗

將RAW 264.7巨噬細(xì)胞以3×104每孔鋪于96孔板，貼壁后分別加入對應(yīng)濃度藥物和陽性對照藥物小白菊內(nèi)酯(10 μmol/L)預(yù)孵育1 h后，加入100 ng/mL LPS，于37 ℃培養(yǎng)23 h。用Griess法測量培養(yǎng)基中累積的亞硝酸鹽作為NO產(chǎn)生的指標(biāo)。將50 μL細(xì)胞培養(yǎng)液、50 μL Griess Ⅰ和50 μL Griess Ⅱ加入96孔板中，室溫孵育10 min，用酶標(biāo)儀在540 nm處檢測其吸光度。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞活力

RAW 264.7細(xì)胞以1.0×103每孔鋪于96孔板，貼壁后加入相應(yīng)濃度藥物于37 ℃孵育24 h，加入5 mg/mL的MTT 10 μL，于37 ℃孵育 4 h，棄去上清液，每孔加入100 μL DMSO，避光孵育10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測吸光度。

1.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

采用TRIZOL法提取細(xì)胞總的mRNA，通過Nanodrop檢測mRNA的濃度以及純度。根據(jù)TaKaRa試劑盒說明進(jìn)行操作，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，待測基因的引物作為模板，通過熒光定量PCR進(jìn)行檢測。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行定量分析，引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列

1.7 蛋白免疫印跡(Western Blot)

通過十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解細(xì)胞，收集裂解后的蛋白，于99 ℃加熱10 min。通過SDS-PAGE凝膠電泳對iNOS、ERK、P-ERK、p38、P-p38、JNK、P-JNK、p65、P-p65、Akt、P-Akt蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測。通過雙色紅外激光成像儀檢測蛋白變化，用ImageJ軟件進(jìn)行圖像分析并進(jìn)行半定量分析。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實驗

根據(jù)IL-6、IL-1β、TNF-α的ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用夾心法檢測細(xì)胞中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。操作步驟如下：

捕獲抗體工作液100 μL過夜包被96孔板，移去液體，清洗孔板；加入100 μL待測樣品，并在室溫孵育2 h，移去液體并清洗孔板；加入100 μL檢測抗體工作液，室溫孵育1 h，棄去液體并清洗孔板；加入100 μL酶結(jié)合物工作液，室溫孵育30 min 棄去上清液并清洗孔板；加入100 μL底物顯色液(TMB)，孵育15 min，加入50 μL終止液，立即用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測量吸光度。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.3(GraphPad，Avenida，CA，USA)統(tǒng)計數(shù)據(jù)，結(jié)果表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)。采用t檢驗分析數(shù)據(jù)，當(dāng)P<0.05 時，認(rèn)為結(jié)果差異性有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 翼莖羊耳菊組分對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響

NO的產(chǎn)生是RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的顯著標(biāo)志之一，因此檢測藥物孵育后對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞上清液中NO含量的影響，可以作為評價藥物抗炎活性的評價指標(biāo)之一[15]。本研究根據(jù)組分極性的差異，將翼莖羊耳菊提取物分為n-BuOH、PE、EA和水溶性組分。通過檢測所得組分對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NO釋放的影響進(jìn)行抗炎活性評估，小白菊內(nèi)酯(P)作為陽性對照。如圖1(a)所示，LPS刺激23 h后，RAW 264.7細(xì)胞上清液NO濃度明顯上升，而組分n-BuOH、PE和EA在50和10 μg/mL對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生的NO均有不同程度的抑制效果，其中EA效果最優(yōu)。因此，在后續(xù)的實驗中，以EA為主要研究對象。

測定了乙酸乙酯組分對NO抑制作用的劑量效應(yīng)曲線，如圖1(b)所示，可見乙酸乙酯組分可以劑量依賴的抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞釋放NO，由劑量效應(yīng)曲線得IC50為1.675 μg/mL。

為了排除細(xì)胞活力對NO釋放的影響，采用MTT的方法檢測不同劑量下藥物對細(xì)胞活力的作用。MTT結(jié)果如圖1(c)所示，在50 μg/mL劑量下，乙酸乙酯組分對細(xì)胞活力影響較為顯著，因此，選擇5、10、20 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實驗。

P，小白菊內(nèi)脂-陽性組；C，空白組；LPS，陰性組與空白組相比，####P<0.000 1；與陰性組相比，**P<0.01，***P<0.001，*****P<0.000 1

2.2 翼莖羊耳菊乙酸乙酯組分[IP(EA)]對RAW 264.7細(xì)胞中iNOS mRNA及其蛋白表達(dá)水平的影響

NO是機(jī)體內(nèi)重要的信號分子，參與細(xì)胞信息交流，具有調(diào)節(jié)免疫、炎癥等重要的生理功能，在生物體內(nèi)NO的合成受到一氧化氮合成酶(NOS)的調(diào)控[16]。在巨噬細(xì)胞中NO主要由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)催化合成[17]。iNOS在巨噬細(xì)胞當(dāng)中同時也是協(xié)助其進(jìn)行免疫反應(yīng)的一類酶。檢測藥物對iNOS表達(dá)量的影響可以進(jìn)一步考察藥物是否通過調(diào)控iNOS從而對NO產(chǎn)生抑制作用的。本研究從mRNA和蛋白水平分別檢測了iNOS表達(dá)的變化。RAW 264.7細(xì)胞與IP(EA)預(yù)孵育1 h后，加入LPS刺激23 h，發(fā)現(xiàn)IP(EA)能夠劑量依賴性地降低LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的iNOS mRNA的表達(dá)(圖2(a))和蛋白的表達(dá)水平(圖2(b))。研究結(jié)果表明，IP(EA)通過抑制iNOS的表達(dá)抑制了NO的產(chǎn)生。

(a) IP(EA)對LPS誘導(dǎo)iNOS的影響

2.3 IP(EA)對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-1β、TNF-α的影響

IL-1β、IL-6以及TNF-α在炎癥反應(yīng)中起到促進(jìn)炎癥的作用，屬于促炎因子，可以分別與靶細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合激活炎癥相關(guān)的信號通路，從而影響炎癥反應(yīng)的進(jìn)程[18]。RAW 264.7作為小鼠的巨噬細(xì)胞系在被LPS等物質(zhì)的刺激情況下可以分泌大量的炎性因子，在促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[18]。本研究從mRNA水平和蛋白水平考察了IP(EA)是否能夠抑制 IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生。如圖3(a)～(c)所示，RAW 264.7細(xì)胞在LPS刺激下IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著上升，而IP(EA)給藥組能夠濃度依賴性的抑制這些炎癥因子的表達(dá)。ELISA檢測結(jié)果(圖3(d)～(f))表明，RAW 264.7細(xì)胞在LPS刺激下IL-6、IL-1β、TNF-α的蛋白表達(dá)量顯著升高，而IP(EA)在5、10、20 μg/mL能夠濃度依賴地顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6蛋白水平，在10和20 μg/mL能夠顯著降低IL-1β和TNF-α的表達(dá)。

(a) 對IL-6 mRNA水平的影響

2.4 IP(EA)對LPS誘導(dǎo)的MAPK通路的影響

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是細(xì)胞內(nèi)一條非常重要的信號通路，主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK通路)、p38絲裂原蛋白激酶(p38通路)和c-Jun氨基末端激酶(JNK通路)3個亞族[19]。MAPK信號通路是重要的炎癥相關(guān)的經(jīng)典通路，MAPK的3個亞族ERK、JNK、p38都和炎癥相關(guān)，這些通路的激活將促使細(xì)胞釋放IL-6、IL-1β等炎癥相關(guān)物質(zhì)。在RAW 264.7細(xì)胞未被激活處于靜息狀態(tài)時，MAPK通路不會被激活；而RAW 264.7細(xì)胞在LPS刺激下，MAPK通路會被迅速激活，ERK、p38、JNK等通路會發(fā)生磷酸化[20]。為了探究IP(EA)是否是通過抑制MAPK信號通路而發(fā)揮抗炎作用，IP(EA)與RAW 264.7細(xì)胞孵育1 h后，LPS刺激30 min，采用蛋白免疫印跡檢測磷酸化的ERK、p38、JNK。如圖4(a)～(c)所示，LPS能夠顯著提高ERK、p38、JNK的磷酸化，而IP(EA)在10和20 μg/mL 條件下能夠劑量依賴性地顯著抑制這些蛋白的磷酸化。因此，IP(EA)是通過抑制MAPK通路而發(fā)揮抗炎活性的。

(a) 對ERK蛋白磷酸化的影響

2.5 IP(EA)對LPS誘導(dǎo)的Akt/NF-κB通路的影響

NF-κB信號通路的激活可誘導(dǎo)炎癥因子如TNF-α、趨化因子以及一些和炎癥級聯(lián)放大相關(guān)的酶如iNOS等的過度表達(dá)，從而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[14]。NF-κB家族包括p65(RelA)、C-Rel、RelB、p50/NF-κB1和p52/NF-κB2五個部分。NF-κB信號通路的激活是LPS誘導(dǎo)iNOS以及多種炎癥因子大量表達(dá)的關(guān)鍵通路[21]。因此，檢測了IP(EA)是否抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的活化。在細(xì)胞處于非激活狀態(tài)下，p65與IκB蛋白結(jié)合并處在細(xì)胞質(zhì)中，而一旦細(xì)胞受到外界刺激，IκB蛋白上游激酶磷酸化激活，使得IκB降解，從而釋放出p65并進(jìn)入細(xì)胞核，同時p65磷酸化[22]。本實驗中，如圖5(a)所示，LPS刺激RAW 264.7細(xì)胞后，p65的磷酸化顯著增加，而IP(EA)能夠顯著抑制p65的磷酸化。

蛋白激酶B(Akt)蛋白是由原癌基因編碼的一種絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，有研究表明Akt處于NF-κB的上游，其磷酸化會激活NF-κB信號通路，從而進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)等生理過程[23-24]。Akt作為IκB蛋白上游激酶，Akt發(fā)生磷酸化時會導(dǎo)致p65活化。因此，進(jìn)一步檢測IP(EA)對AKT磷酸化的影響，如圖5B所示，LPS能夠顯著誘導(dǎo)Akt的磷酸化，而IP(EA)能夠劑量依賴性的降低LPS誘導(dǎo)的Akt的磷酸化。由此表明，IP(EA)是通過抑制Akt/NF-κB信號通路從而發(fā)揮抗炎作用。

(a) 對p65蛋白磷酸化的影響

3 結(jié) 論

研究發(fā)現(xiàn)，翼莖羊耳菊提取物的乙酸乙酯組分抗炎活性最為明顯，在LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞上，IP(EA)可以通過影響iNOS的表達(dá)而抑制細(xì)胞內(nèi)NO的產(chǎn)生；在mRNA以及蛋白水平均可以顯著抑制炎性因子IL-1β、IL-6以及TNF-α的表達(dá)。IP(EA)顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)MAPK、p65以及Akt的磷酸化，表明MAPK、NF-κB以及Akt信號通路參與了IP(EA)的抗炎過程。