石榴酸誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)理

陳 晨， 陳 紅 州， 王 晗

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

共軛亞麻酸(CLNA)是一組含有3個共軛雙鍵的十八碳三烯酸的位置、幾何異構(gòu)體的總稱，主要來源于植物的種子[1-2]。研究表明，共軛亞麻酸具有減肥、調(diào)節(jié)脂代謝和抗腫瘤等功效[3-4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，共軛亞麻酸的雙鍵位置和構(gòu)像的差異對其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用有一定的影響[5]。石榴酸(C18：3 c9，tl1，c13，PUA)是共軛亞麻酸的一種異構(gòu)體，主要存在于石榴籽和苦瓜籽中[6]。但是，石榴酸對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)理尚不明確。

研究表明，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)可以通過二聚體化與特異的DNA作用元件結(jié)合，啟動下游靶基因的表達(dá)。PPARγ的激活可以抑制胰腺癌和非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的進(jìn)展和巨噬細(xì)胞活化[7]。活性氧(ROS)的產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化也與共軛亞麻酸的抗腫瘤作用有關(guān)。Moon[8]和Sun[9]等分別證明α-桐酸(C18：3 c9，tl1，t13，α-eleostearic acid，α-ESA)能夠通過影響PPARγ的活化和ROS的產(chǎn)生誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞和膀胱癌T24細(xì)胞的凋亡。但是，石榴酸對腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。

子宮內(nèi)膜癌是一種女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[10-11]，而子宮內(nèi)膜樣腺癌是子宮內(nèi)膜癌中最常見的類型[12-13]。目前的治療方法以化療和手術(shù)為主。但化療在降低致死率的同時，產(chǎn)生較大的副作用[14]。食品來源的活性物質(zhì)具有毒副作用小等特點，因此研究植物油來源的石榴酸對子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)理，以期為其輔助治療提供實驗依據(jù)。

本實驗以子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞RL-952作為研究對象，以α-亞麻酸和α-桐酸為對照，分析了石榴酸對RL-952細(xì)胞凋亡的影響，并通過PPARγ抑制劑T0070907和ROS清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)對石榴酸的作用機(jī)理進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸(純度98%)，美國Cayman化學(xué)公司；子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞RL-952，中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM/F12培養(yǎng)基，美國Invitrogen公司；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒，杭州碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清(FBS)，天津市灝洋生物制品有限責(zé)任公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒，鉑優(yōu)生物技術(shù)有限公司；抗β-actin、Bax、Bcl-2、PPARγ、Caspase-3、p53抗體，美國Santa Cruz生物技術(shù)公司；辣根過氧化物酶聯(lián)二抗，北京中杉金橋生物公司；T0070907，美國Cayman化學(xué)公司；Hoechst33342 熒光染料、2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(H2DCFDA)活性氧標(biāo)記、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)，江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

酶標(biāo)儀，Tecan Austia GmbH；CO2恒溫培養(yǎng)箱，日本三洋電機(jī)株式會社；流式細(xì)胞儀，美國貝克曼公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀，大連競邁生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

接種RL-952細(xì)胞至含雙抗和10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3代后取對數(shù)生長期RL-952細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞活力

分別將α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸溶解在乙醇中。取對數(shù)期的RL-952細(xì)胞離心重懸至含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，以2×103mL-1接種至96孔板，并于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h[15]。更換培養(yǎng)基并分別加入α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸，使終濃度為10、20、40、80、160 μmol/L。以單獨加入溶劑乙醇組為陰性對照，每組設(shè)置3次平行實驗。繼續(xù)在恒溫培養(yǎng)箱中孵育48 h，加入1.2 μmol/mL的MTT 20 μL，并在恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。4 h后吸去上清，每孔加入DMSO 150 μL靜置10 min，振蕩1 min后用酶標(biāo)儀檢測570 nm處吸光度。

1.2.3 Hoechst33342熒光染色觀察凋亡細(xì)胞核形態(tài)

RL-952細(xì)胞以40 μmol/L的α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸分別處理48 h后，以磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞，加入培養(yǎng)基并使Hoechst33342終濃度達(dá)到1.6 μmol/mL，繼續(xù)孵育10 min，在熒光顯微鏡下應(yīng)用紫外激發(fā)觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

分別以40 μmol/L的α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸處理RL-952細(xì)胞48 h，胰酶消化后離心。500 μL Annexin V Binding Buffer重懸細(xì)胞后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長530 nm檢測細(xì)胞凋亡的情況。

1.2.5 蛋白免疫印跡

從RL-952細(xì)胞提取總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并通過轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)印至PVDF膜[16]。5%脫脂奶粉封閉PVDF膜一抗孵育過夜，PBST洗滌，二抗孵育1 h，PBST洗滌，ECL顯影并通過凝膠成像儀拍照，分析實驗結(jié)果。

1.2.6 ROS檢測

分別以40 μmol/L的α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸處理細(xì)胞48 h，PBS洗滌，以10 μmol/L的DCFH-DA孵育30 min后，用PBS洗滌后收集細(xì)胞，應(yīng)用熒光分光光度計，對各組的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)，計算不同脂肪酸處理組相對于陰性對照組的相對熒光強(qiáng)度。每組設(shè)置3次平行實驗。

1.2.7 抑制實驗

T0070907抑制實驗：陰性對照組，單獨脂肪酸組(分別添加40 μmol/L α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸)，單獨T0070907組(10 μmol/L)，脂肪酸+T0070907組。每組設(shè)置3次平行實驗。

ROS清除劑NAC拮抗實驗：陰性對照組，單獨脂肪酸組(分別添加40 μmol/L α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸)；單獨NAC組(5 mmol/L)，脂肪酸+NAC組。處理細(xì)胞48 h后，檢測細(xì)胞活力。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)以(均值±SD)表示，采用Origin2017 軟件應(yīng)用t檢驗和方差分析進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表明數(shù)據(jù)間具有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 石榴酸對RL-952細(xì)胞活力的影響

如圖1所示，與α-亞麻酸相比，α-桐酸和石榴酸能夠顯著降低RL-952細(xì)胞的相對細(xì)胞活力(P<0.05)，且隨著脂肪酸處理濃度的增加，相對細(xì)胞活力的下降更為明顯。同時，在相同濃度脂肪酸處理下，與α-桐酸相比，石榴酸處理組相對細(xì)胞活力的下降更為顯著(P<0.05)。結(jié)果提示石榴酸抑制RL-952細(xì)胞活力的作用更強(qiáng)。

圖1 石榴酸對RL-952相對細(xì)胞活力的影響

2.2 石榴酸對RL-952細(xì)胞核形態(tài)的影響

如圖2所示，正常細(xì)胞核(陰性對照組)邊緣整齊，內(nèi)部均勻且熒光較弱。與α-亞麻酸對照組相比，α-桐酸組和石榴酸組的細(xì)胞核凋亡形態(tài)學(xué)改變明顯，均出現(xiàn)了較多的細(xì)胞核皺縮和顆粒狀強(qiáng)熒光的形態(tài)學(xué)變化。其中，石榴酸組細(xì)胞核的凋亡形態(tài)學(xué)改變較α-桐酸處理組更為明顯。

(a) 對照組

2.3 石榴酸對RL-952細(xì)胞凋亡率的影響

如圖3所示，與α-亞麻酸對照組相比，α-桐酸和石榴酸均具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)RL-952細(xì)胞凋亡的作用，其細(xì)胞凋亡率分別達(dá)到44.9%和68.2%。表明石榴酸對子宮內(nèi)膜腺癌RL-952細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用強(qiáng)于α-桐酸。

(a) 對照組

2.4 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化

Caspase-3是凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，可直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bax屬于促凋亡蛋白，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，可抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞生命。因此通過對不同脂肪酸處理的細(xì)胞進(jìn)行蛋白免疫印跡分析，可比較石榴酸處理前后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。如圖4所示，與α-亞麻酸對照組相比，α-桐酸和石榴酸處理后Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2 表達(dá)明顯降低，因此Bax/Bcl-2的表達(dá)比例明顯上調(diào)。石榴酸處理組Bax/Bcl-2的表達(dá)比例上調(diào)最明顯，與Hoechst33342熒光染色細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化以及流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果一致。由于Bcl-2蛋白家族可以通過影響線粒體膜通透性參與凋亡的內(nèi)源途徑，因此，石榴酸能明顯提高Bax/Bcl-2比值，提示其作用可能與凋亡的內(nèi)源途徑有關(guān)。

圖4 石榴酸對RL-952細(xì)胞中Bax，Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.5 石榴酸對PPARγ和p53蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與α-亞麻酸和α-桐酸的作用相比，石榴酸提高RL-952細(xì)胞PPARγ和p53蛋白表達(dá)水平的作用更為明顯。腫瘤抑制因子p53作為凋亡活化基因可以通過非轉(zhuǎn)錄依賴方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡，且可以轉(zhuǎn)移定位到線粒體，參與Bcl-2蛋白家族對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)[17]。因此，p53蛋白表達(dá)的上調(diào)進(jìn)一步證明石榴酸的作用與線粒體膜的通道作用有關(guān)。石榴酸處理后，RL-952細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)水平的上調(diào)，提示石榴酸的作用可能與PPARγ通路有關(guān)。

圖5 石榴酸對RL-952細(xì)胞中PPARγ和p53蛋白表達(dá)的影響

2.6 T0070907拮抗石榴酸對RL-952細(xì)胞活力的影響

如圖6所示，單獨添加T0070907組細(xì)胞活力與對照組相比沒有顯著性差異。α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸分別處理后，相對細(xì)胞活力顯著下降，而α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸分別與T0070907聯(lián)合應(yīng)用處理RL-952細(xì)胞后，各組細(xì)胞的相對細(xì)胞活力顯著提高，其中石榴酸組細(xì)胞活力提高最明顯。結(jié)果提示石榴酸對RL-952細(xì)胞的影響與PPARγ信號通路有關(guān)。

圖6 T0070907對石榴酸處理的RL-952細(xì)胞相對細(xì)胞活力的影響

2.7 石榴酸對RL-952細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響

如圖7所示，與陰性對照組相比，α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS的水平分別增加至1.2、1.4和1.7倍左右，其中石榴酸促進(jìn)細(xì)胞ROS產(chǎn)生的作用最顯著。

圖7 熒光分光光度法檢測石榴酸對RL-952細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響

2.8 NAC拮抗石榴酸對RL-952細(xì)胞活力的抑制作用

如圖8所示，單獨添加NAC對RL-952細(xì)胞的相對細(xì)胞活力沒有顯著的影響；單獨添加α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸后，相對細(xì)胞活力顯著下降；聯(lián)合應(yīng)用NAC能夠顯著提高α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸處理細(xì)胞的相對細(xì)胞活力。NAC對石榴酸組細(xì)胞的拮抗作用最為顯著。結(jié)果提示ROS的產(chǎn)生可能參與了石榴酸對RL-952細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。

圖8 NAC拮抗石榴酸對RL-952細(xì)胞活力的抑制作用

3 結(jié) 論

石榴酸可抑制子宮內(nèi)膜樣腺癌RL-952細(xì)胞的細(xì)胞活力，促進(jìn)RL-952細(xì)胞的凋亡，且與另一種共軛亞麻酸異構(gòu)體α-桐酸相比，作用更強(qiáng)。在石榴酸的作用下，凋亡相關(guān)蛋白酶Caspase-3表達(dá)明顯上調(diào)，凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2的比例明顯上調(diào)。同時，石榴酸可上調(diào)PPARγ和p53蛋白的表達(dá)，PPARγ抑制劑T0070907可以顯著拮抗石榴酸對RL-952細(xì)胞活力的影響。石榴酸能夠顯著提高RL-952細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，ROS清除劑NAC也可以顯著拮抗石榴酸抑制RL-952細(xì)胞活力的作用，提示石榴酸誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜腺癌RL-952細(xì)胞凋亡的作用與其對PPARγ通路的調(diào)節(jié)和ROS產(chǎn)生的影響有關(guān)。

但是，本研究僅對石榴酸誘導(dǎo)RL-952細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，在今后的實驗中，其他相關(guān)信號通路的作用以及信號通路之間的相互作用，仍有待深入的研究。