CYP2C9、VKORC1基因多態(tài)性在PTE患者華法林抗凝治療中的應(yīng)用分析

宮小薇，袁雅冬，貢瑩，田甜甜，康世威

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)二科，石家莊 050000)

靜脈血栓栓塞癥包括深靜脈血栓形成和肺血栓栓塞癥(pulmonary thromboembolism，PTE)，年發(fā)病率為(100～200)/10萬，是第三大常見心血管疾病[1]。急性PTE是靜脈血栓栓塞癥最嚴(yán)重的一種類型。有研究顯示，肺栓塞的總發(fā)生率為5%～14%(高齡人群可達(dá)25%)，病死率達(dá)30%[2]，40歲以上人群年齡每增加10歲PTE的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加近1倍[3]。華法林在血栓性疾病深靜脈血栓形成、PTE等抗凝治療中發(fā)揮重要作用，但臨床研究發(fā)現(xiàn)，華法林的個(gè)體治療劑量差異較大，如需達(dá)到同等的抗凝效果，不同患者所需的華法林劑量不同，劑量最大者可為劑量最小者的20倍[4]。臨床治療中需反復(fù)監(jiān)測國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international normalized ratio，INR)來確定華法林用量[5]，但治療效果和出血風(fēng)險(xiǎn)難以把控，且患者的依從性差，如何有效實(shí)施華法林個(gè)體化治療成為臨床研究的重點(diǎn)。

隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)，華法林代謝酶細(xì)胞色素P450氧化酶2C9(cytochrome P450 proteins 2C9，CYP2C9)和華法林作用靶點(diǎn)維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1(vitamin K epoxide reductase complex 1，VKORC1)基因多態(tài)性可影響其藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)，能夠解釋約45%的華法林劑量個(gè)體差異[6-7]。根據(jù)CYP2C9、VKORC1基因多態(tài)性指導(dǎo)華法林的應(yīng)用，對(duì)制訂個(gè)性化治療方案具有重要意義，目前臨床上關(guān)于CYP2C9、VKORC1基因多態(tài)性的研究多集中于華法林應(yīng)用劑量方面，指導(dǎo)華法林應(yīng)用的研究較少?；诖?，本研究主要探討CYP2C9、VKORC1基因多態(tài)性在PTE患者華法林抗凝治療中的應(yīng)用效果，以期為臨床上華法林的合理有效應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2020年6月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院收治的163例PTE患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合急性PTE的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8],確診為PTE患者；②年齡≥18周歲；③需要華法林抗凝治療超過3個(gè)月；④患者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有華法林應(yīng)用史；②伴有活動(dòng)性出血；③合并有血液系統(tǒng)或凝血功能異常性疾?。虎芎喜⒂袊?yán)重感染；⑤合并有惡性腫瘤；⑥正在服用可影響華法林藥效學(xué)或藥動(dòng)學(xué)藥物以及類似抗凝藥物的其他藥物；⑦依從性差，無法配合完成全程治療及試驗(yàn)。根據(jù)華法林用藥方式不同分為研究組(82例)和對(duì)照組(81例)。研究組男37例、女45例，年齡30～80歲，平均(55.1±13.7)歲；合并癥：合并高血壓47例、糖尿病6例、冠心病25例。對(duì)照組男34例、女47例，年齡28～82歲，平均(55.4±14.1)歲；合并癥：合并高血壓51例、糖尿病7例、冠心病22例。兩組患者性別、年齡等基線資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2方法

1.2.1主要儀器和試劑 SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋(上海勝衛(wèi)電子科技有限公司)；HFsafe-900TE型生物安全柜(上海力新儀器有限公司)；旋渦混合器(美國Thermo Fisher公司)；微量臺(tái)式離心機(jī)(美國BECKMAN公司)；NES-32型核酸提取儀(杭州艾康生物技術(shù)有限公司)；定性聚合酶鏈反應(yīng)儀(美國ABI2720公司)；BE-2.0型生物芯片識(shí)讀儀、BR-526-24型全自動(dòng)雜交儀(上海百傲科技股份有限公司)；微量移液槍(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；限制性內(nèi)切酶(美國Thermo Fisher公司)；磁珠法全血基因組DNA提取試劑盒、芯片法CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性檢測試劑盒、化學(xué)純無水乙醇和異丙醇(無錫百泰克生物技術(shù)有限公司)；引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司設(shè)計(jì)及合成。

1.2.2基因檢測 采集研究組患者外周靜脈血4 mL，乙二胺四乙酸抗凝管保存，嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒說明書提取DNA，并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，0.5 μL上下游引物+0.25 μL棲熱水生菌DNA聚合酶+5 μL 緩沖液+0.5 μL脫氧核糖核苷三磷酸+0.5 μL DNA+雙蒸水補(bǔ)足至20 μL，95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min共35個(gè)循環(huán)后，72 ℃ 7 min，4 ℃ 10 min，3%瓊脂糖電泳鑒定。繼而進(jìn)行酶切反應(yīng)，2 μL緩沖液+0.6 μL 5 U限制性內(nèi)切酶AciⅠ+8 μL聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物+9 μL雙蒸水，37 ℃水浴16 h，3%瓊脂電泳分析基因類型。最終得到CYP2C9的基因型分別為*1/*1(*2CC/*3AA)野生型、*1/*3(*2CC/*3AC)突變型和*3/*3(*2CC/*3CC)突變型，VKORC1基因型分別為AA野生型、GA突變型和GG突變型。

1.2.3劑量設(shè)計(jì) 根據(jù)2015版《藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測技術(shù)指南(試行)》[9]中我國人群推薦華法林的用藥劑量計(jì)算公式，以CYP2C9和VKORC1不同基因分型計(jì)算華法林(芬蘭Orion Corporation生產(chǎn)，批號(hào)：1615356)應(yīng)用劑量。

研究組患者在第1～3天以基因計(jì)算的劑量為初始劑量進(jìn)行治療，對(duì)照組在治療第1～3天以3 mg/d為初始劑量進(jìn)行治療，治療第4天開始，兩組均根據(jù)INR檢測結(jié)果調(diào)整使用劑量。

1.3觀察指標(biāo) 比較兩組患者華法林起始劑量、維持劑量、INR首次達(dá)標(biāo)時(shí)華法林總劑量、日平均華法林劑量，INR達(dá)標(biāo)(INR值定為2～3)時(shí)間、INR檢測次數(shù)、住院時(shí)間、總醫(yī)療費(fèi)用，以及不良反應(yīng)發(fā)生情況。

2 結(jié) 果

2.1研究組患者基因型分布情況 研究組82例患者中CYP2C9基因型為*1/*1(*2CC/*3AA)野生型74例、*1/*3(*2CC/*3AC)突變型7例、*3/*3(*2CC/*3CC)突變型1例，VKORC1基因型為AA野生型67例、GA突變型12例、GG突變型3例。

2.2兩組患者華法林應(yīng)用情況比較 研究組患者華法林起始劑量、維持劑量、INR首次達(dá)標(biāo)時(shí)華法林總劑量和日平均華法林劑量均明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，見表1。

表1 兩組PTE患者華法林應(yīng)用情況比較

2.3兩組患者治療情況比較 研究組患者INR達(dá)標(biāo)時(shí)間、住院時(shí)間明顯短于對(duì)照組(P<0.01)，INR檢測次數(shù)、總醫(yī)療費(fèi)用明顯少于對(duì)照組(P<0.01)，見表2。

表2 兩組PTE患者治療情況比較

2.4兩組不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 研究組牙齦出血、鼻衄、皮下瘀斑、顱內(nèi)出血、尿血、便血及總不良反應(yīng)發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 兩組PTE患者不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 [例(%)]

3 討 論

2014年歐洲心臟學(xué)會(huì)肺栓塞指南報(bào)道，通過對(duì)6個(gè)歐洲國家45 400余萬總?cè)丝诹餍胁W(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，約34%的患者死于突發(fā)致命性PTE，59%的患者死于生前未診斷出的PTE，僅有7%的患者在死前明確診斷出PTE，部分存活者還可伴發(fā)血栓形成后綜合征，并且具有較高的慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓風(fēng)險(xiǎn)，給衛(wèi)生保健系統(tǒng)帶來了巨大負(fù)擔(dān)[10]。而靜脈血栓栓塞癥不良預(yù)后多與首次達(dá)標(biāo)時(shí)間延長、抗凝強(qiáng)度不夠、抗凝強(qiáng)度不穩(wěn)定、療程不足等因素相關(guān)[11]。因此，制訂華法林的個(gè)體化治療方案、維持治療穩(wěn)定性是保證治療效果、改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。

華法林在急性肺栓塞、PTE等血栓性疾病的抗凝治療中具有重要作用，但要達(dá)到穩(wěn)定的抗凝效果，抗凝強(qiáng)度指標(biāo)INR必須維持在2.0～3.0，而因個(gè)體差異等因素影響，INR能夠維持在有效范圍內(nèi)的時(shí)間只占總體治療時(shí)間的40%～60%，明顯增加了患者出血或再栓塞的風(fēng)險(xiǎn)[12-13]。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)是醫(yī)學(xué)科技發(fā)展的前沿方向，加強(qiáng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究對(duì)推動(dòng)重大疾病防控技術(shù)的發(fā)展至關(guān)重要[14]。CYP2C9作為華法林的S異構(gòu)體代謝酶，其*2與*3位點(diǎn)基因變異可導(dǎo)致CYP2C9酶活性降低，致使華法林S異構(gòu)體代謝減弱，華法林血藥濃度增加，出現(xiàn)過度抗凝，增加出血風(fēng)險(xiǎn)[15-16]。有研究顯示，CYP2C9的*2與*3位點(diǎn)基因變異可分別使華法林S異構(gòu)體代謝降低30%～40%和80%～90%[17-18]，故此類人群達(dá)到相同的抗凝強(qiáng)度，所需華法林劑量明顯減少。VKORC1作為維生素K依賴性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ活化限速酶，是血液凝固、血栓形成的關(guān)鍵酶，而華法林作為一種維生素K拮抗劑，可通過競爭VKORC1的結(jié)合位點(diǎn)抑制VKORC1的作用而發(fā)揮抗凝作用[19]。有研究證實(shí)，VKORC1-1639 A/G位點(diǎn)基因多態(tài)性與華法林劑量個(gè)體差異密切相關(guān)，若該位點(diǎn)等位基因A突變?yōu)榈任换騁，可促使VKORC1蛋白合成及其酶的活性明顯增加[20-21]，此類人群應(yīng)用華法林抗凝，若想達(dá)到相同的抗凝強(qiáng)度，所需華法林劑量明顯增加，即VKORC1-1639 G等位基因攜帶人群所需的華法林劑量較VKORC1-1639 A等位基因攜帶人群明顯增加，INR首次達(dá)標(biāo)時(shí)間也明顯延長。本研究結(jié)果顯示，研究組患者華法林起始劑量、維持劑量、INR首次達(dá)標(biāo)時(shí)華法林總劑量和日平均華法林劑量均明顯低于對(duì)照組，INR達(dá)標(biāo)時(shí)間及住院時(shí)間明顯短于對(duì)照組，INR檢測次數(shù)及總醫(yī)療費(fèi)用明顯少于對(duì)照組(P<0.01)，華法林用量精確，療效顯著。許建文等[22]研究結(jié)果顯示，CYP2C9、VKORC1基因多態(tài)性可影響華法林的谷濃度及維持劑量，本研究結(jié)果與該結(jié)果類似?？梢姡ㄟ^CYP2C9、VKORC1基因多態(tài)性指導(dǎo)華法林的應(yīng)用，對(duì)精確華法林用量，提高治療效果具有重要意義。但本研究中兩組總不良反應(yīng)發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能與本研究樣本量較小有關(guān)，有待進(jìn)一步多中心大樣本研究驗(yàn)證。另外，華法林的藥物不良反應(yīng)主要發(fā)生在給藥初期(初始給藥90 d內(nèi))，準(zhǔn)確預(yù)測華法林初始給藥劑量、減少劑量波動(dòng)是華法林個(gè)體化治療急需解決的關(guān)鍵問題。

綜上所述，與常規(guī)以3 mg/d為初始劑量的治療方法相比，以CYP2C9、VKORC1基因多態(tài)性為指導(dǎo)的華法林治療可顯著減少華法林用量，縮短INR達(dá)標(biāo)時(shí)間和住院時(shí)間，對(duì)提高患者健康水平、減少無效和過度醫(yī)療、強(qiáng)化精準(zhǔn)醫(yī)療具有重要意義。