14-3-3蛋白在水稻籽粒灌漿過(guò)程中的互作靶蛋白鑒定及其對(duì)外源激素的響應(yīng)

張志興 ，敏秀梅 ，宋果 ，陳花 ，許海龍 ，林文雄 ?

1福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2福建農(nóng)林大學(xué)/福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002

0 引言

【研究意義】14-3-3蛋白是植物中普遍存在的一類對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育及環(huán)境響應(yīng)起重要作用的調(diào)節(jié)蛋白[1]，探明14-3-3蛋白在水稻籽粒灌漿過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)模式及功能，對(duì)揭示14-3-3蛋白調(diào)控水稻產(chǎn)量與品質(zhì)的形成具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】14-3-3蛋白主要以同源或異源二聚體形式存在，可以同時(shí)與2個(gè)靶蛋白或者與1個(gè)靶蛋白的2個(gè)結(jié)構(gòu)域相互作用，通過(guò)與靶蛋白上一小段共有序列的磷酸化絲氨/蘇氨酸殘基結(jié)合來(lái)發(fā)揮其調(diào)控功能，其主要結(jié)合模式有RSXpSXP（I型），RXXXpSXP（II型）和 pS/TX-COOH（III型），其中pS和pT分別代表Ser和Thr[2]。14-3-3蛋白通過(guò)上述3種磷酸化結(jié)合模式與其靶蛋白互作，保證了14-3-3蛋白在生物體中的重要調(diào)節(jié)功能。在植物中，借助親和層析和酵母雙雜交等方法，已鑒定到300多種與14-3-3蛋白互作的靶蛋白，涉及植物體內(nèi)多種激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和代謝過(guò)程[3-4]。例如，14-3-3蛋白作為一個(gè)接頭因子能夠?qū)?ABA效應(yīng)因子 VP1（viviparous 1）與受ABA誘導(dǎo)的順式作用元件ABRE（ABA-responsive element）聯(lián)系起來(lái)，共同調(diào)控下游ABA應(yīng)答基因的表達(dá)[5]。14-3-3蛋白通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子BZR（BRASSINAZOLE-RESISTANT）的相互作用，在植物體內(nèi) BR信號(hào)通路中起到負(fù)調(diào)控作用[6]。酵母雙雜交系統(tǒng)證實(shí)水稻14-3-3蛋白能夠和參與乙烯合成的 ACC合成酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase）互作[7]。在模式植物擬南芥中的研究表明，超表達(dá)14-3-3蛋白，會(huì)顯著抑制TCA循環(huán)及糖酵解途徑中關(guān)鍵酶的活性，從而導(dǎo)致植株糖及含氮化合物含量下降[8]。在鑒定到的 14-3-3靶蛋白中，有很大一部分是與植物淀粉合成代謝相關(guān)的，例如蔗糖合成酶（SuS），淀粉合成酶I（SSI）、淀粉合成酶II （SSII），淀粉分支酶同工酶（SBEIIa、SBEIIb）及 ADP焦磷酸化酶大亞基（AGPL）等[9-11]。由此可見(jiàn)，14-3-3蛋白在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及碳代謝中發(fā)揮著重要的作用。眾所周知，淀粉合成是籽粒灌漿過(guò)程中最重要的代謝途徑之一，在這過(guò)程中腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉合成酶（StS），SuS和淀粉分支酶（SBE）及淀粉去分支酶（DBE）等基因的表達(dá)變化及酶活性的高低對(duì)淀粉合成具有重要的影響[12-13]。此外，植物內(nèi)源激素在籽粒的庫(kù)容及千粒重的形成過(guò)程中起到了重要的調(diào)節(jié)作用。已有研究表明，籽粒中ABA/IAA、ABA/GA1+3和ABA/（IAA+GA1+3+ ZRS+ABA）的比值與籽粒的灌漿充實(shí)密切相關(guān)[14]。ZHANG[15]及YANG等[16]研究表明灌漿期適度干旱脅迫能改變籽粒中 ABA的含量，進(jìn)而提高SuS、AGPase、StS及SBE的活性。一些學(xué)者認(rèn)為籽粒中較高濃度的 GA會(huì)降低 StS和SuS的活性，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)實(shí)率和產(chǎn)量顯著下降[17]。已如上述，植物14-3-3蛋白會(huì)通過(guò)與其互作靶蛋白結(jié)合，進(jìn)而參與多種激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及淀粉合成過(guò)程。例如，水稻籽粒14-3-3蛋白會(huì)響應(yīng)外源ABA處理而出現(xiàn)顯著的蛋白表達(dá)及磷酸化修飾的變化，暗示著14-3-3蛋白參與了 ABA調(diào)控籽粒灌漿的過(guò)程[18]。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白成員GF14f在弱勢(shì)籽粒灌漿過(guò)程中蛋白表達(dá)量相對(duì)強(qiáng)勢(shì)籽粒較大，是導(dǎo)致弱勢(shì)籽粒灌漿結(jié)實(shí)差的一個(gè)重要的原因[19]。YOU等[20]發(fā)現(xiàn)移除穗頂端的強(qiáng)勢(shì)籽粒后，底端的弱勢(shì)籽粒中淀粉合成關(guān)鍵酶活性、千粒重及結(jié)實(shí)率顯著得到提高，并進(jìn)一步通過(guò)差異蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)弱勢(shì)籽粒中 14-3-3蛋白的表達(dá)量顯著下降?？梢?jiàn)，水稻 14-3-3蛋白家族在籽粒灌漿過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】水稻籽粒灌漿完成情況對(duì)產(chǎn)量及品質(zhì)的形成至關(guān)重要。目前為止，在水稻中共鑒定到8個(gè)14-3-3蛋白家族成員（命名為 GF14a-h）[21-23]，但對(duì)其在籽粒灌漿過(guò)程中的表達(dá)變化模式及其調(diào)控機(jī)制仍缺乏系統(tǒng)的分析。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究擬運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析14-3-3基因家族在水稻籽粒灌漿不同時(shí)期的表達(dá)變化模式，并采用親和層析技術(shù)鑒定籽粒中與 14-3-3蛋白互作的靶蛋白，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)籽粒灌漿期外源激素的處理，探明14-3-3及其互作靶基因在籽粒灌漿過(guò)程中對(duì)激素調(diào)控的響應(yīng)，以期揭示14-3-3蛋白在水稻籽粒灌漿過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用大穗型常規(guī)水稻“金恢 809”為試驗(yàn)材料，于2014年在福建農(nóng)林大學(xué)（福建省福州市）的校內(nèi)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行，采用桶栽土培的方法進(jìn)行水稻的種植。水稻種子通過(guò)多菌靈滅菌清洗后，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱，保持其濕潤(rùn)狀態(tài)。3月20日播種，采用旱育方式育秧，4月20日移栽至塑料桶（40 cm×40 cm）中，每桶移栽3株，單本插。桶栽所用的土壤取自大田水稻土，移栽水稻后的塑料桶放置于頂部覆蓋有塑料薄膜的網(wǎng)室內(nèi)。在水稻全生育期每桶施尿素3.9 g，磷酸鈣6.56 g，氯化鉀2.1 g，其中60%尿素，50%氯化鉀和100%磷酸鈣作為基肥，40%尿素和50%氯化鉀作為穗肥施用，其他栽培措施與常規(guī)的水稻栽培一致。在水稻抽穗開(kāi)花期，選取長(zhǎng)勢(shì)一致、同一天開(kāi)花抽穗的主穗進(jìn)行掛牌標(biāo)記，在花后5—30 d，每隔5 d收集籽粒樣品，液氮速凍后保存于-80℃冰箱中。在水稻花后15 d，分別對(duì)籽粒進(jìn)行外源激素噴施處理，激素濃度的設(shè)置參照 YAO[22]，YANG[24]，ZHANG[25]及李贊堂[26]等的研究報(bào)道，分別為 25×10-6mol·L-1ABA，10×10-6mol·L-1IAA，100×10-6mol·L-1GA，50×10-6mol·L-1ZR 和 2×10-4mol·L-1BR，在噴施激素3 h后，收集籽粒樣品用于qRT-PCR分析。

1.2 主要試劑

大腸桿菌BL21和原核表達(dá)載體PGEX-6P-1，由筆者實(shí)驗(yàn)室保存提供。Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，基因克隆載體pMD18-T Vector購(gòu)自TaKaRa公司。植物激素脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）、油菜素內(nèi)酯（BR）和吲哚乙酸（IAA）購(gòu)自Sigma公司；玉米素（ZT）購(gòu)自Aladdin公司。總RNA提取試劑Trizol購(gòu)自TaKaRa公司；cDNA合成試劑盒TIANscript RT Kit、qRT-PCR試劑SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；蛋白親和吸附基質(zhì) Glutathione SepharoseTM 4B及 Ni-Sepharose 6 Fast flow購(gòu)自GE公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

選取灌漿不同時(shí)期的水稻籽粒，去殼后，采用Trizol法提取總 RNA，cDNA第一條鏈合成按照TIANGEN公司TIANscript RT Kit試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行。依據(jù) NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到的 8個(gè)水稻14-3-3基因的編碼序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)相應(yīng)的qRT-PCR引物，如表1所示。qRT-PCR采用TIANGEN公司SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒進(jìn)行。β-actin作為內(nèi)參，基因的相對(duì)表達(dá)量采用 2-ΔΔCt的方法進(jìn)行計(jì)算。

表1 試驗(yàn)中用到的qRT-PCR和PCR的引物Table 1 qRT-PCR and PCR primers used in this study

1.4 親和層析分析

以水稻籽粒cDNA為模板，按表1中的引物序列，擴(kuò)增GF14b、GF14e的開(kāi)放閱讀框（ORF），并克隆到表達(dá)載體 PGEX-6P-1中，構(gòu)建 GST-GF14b及GST-GF14e融合蛋白表達(dá)載體。之后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，菌體超聲破碎后，離心，將上清液轉(zhuǎn)入Glutathione SepharoseTM 4B吸附柱中，加入15倍柱床體積的PBS緩沖液洗滌柱子，還原型谷胱甘肽洗脫液洗脫后，采用SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白純化結(jié)果。將灌漿不同時(shí)期的水稻籽粒樣品去殼混合，液氮研磨，每1 g籽粒加入1 mL含有 50 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.5）、150 mmol·L-1NaCl、4 mmol·L-1MgCl2、0.5 mmol·L-1EDTA、0.5%NP-40、2 mmol·L-1DTT、1 mmol·L-1PMSF 提取緩沖液中，充分混勻，冰上30 min后，4°C 11 000 r/min離心20 min，取上清液，0.22 μm濾膜過(guò)濾除雜，獲得籽粒非變性全蛋白粗提液。之后，將提取液分別加入GST-GF14b及GST-GF14e融合蛋白的親和吸附柱中，4℃孵育過(guò)夜，加入15倍柱床體積的PBS洗滌5次，還原型谷胱甘肽洗脫后，進(jìn)行冷凍濃縮處理，再采用SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。

1.5 靶蛋白質(zhì)譜鑒定

切取 SDS-PAGE膠上蛋白條帶，裝于 1.5 mL離心管中，胰蛋白酶酶解后，用于LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定。液相采用高速液相色譜系統(tǒng) Ultimate 3000（ThermoFisher Scientific），利用色譜柱BioBasic C18 Column（100×0.18 mm，particle size：5 um）對(duì)肽段進(jìn)行分離。LTQ-XL（Thermo Scientific）質(zhì)譜的具體參數(shù)為：噴霧電壓條件設(shè)為3.5 kV；母離子掃描的范圍為400—2 000 m/z；Isolation width為2 Da。二級(jí)質(zhì)譜條件：AGC Target 1e4，1 microscans；碰撞能量：35% CID，CID掃描后選擇前10個(gè)最高豐度的離子進(jìn)行PQD掃描。質(zhì)譜分析所獲得的原始數(shù)據(jù)用Proteome Discoverer1.2軟件進(jìn)行相對(duì)定量分析，并利用RGAP7.0蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http://rice.plantbiology.msu.edu）進(jìn)行蛋白檢索，選擇至少有2個(gè)獨(dú)立肽段匹配的蛋白作為可信蛋白，F(xiàn)DR閾值設(shè)為＜5%。

1.6 體外GST-pull down驗(yàn)證

依據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果，隨機(jī)選擇2個(gè)靶蛋白Sucrose synthase 3（SUS3）和Puromycin-sensitive aminopeptidase（PSA），以籽粒的cDNA為模板，按照表1中的引物序列，將擴(kuò)增的SUS3和PSA的序列克隆到表達(dá)載體pet32a中，構(gòu)建His-SUS3及His-PSA融合表達(dá)載體。采用Ni-Sepharose 6 Fast flow對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，咪唑洗脫液洗脫，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。將純化好的His-SUS3及His-PSA融合表達(dá)蛋白，分別加入吸附有GST-GF14b及GST-GF14e融合蛋白的親和吸附柱中，4℃孵育過(guò)夜，還原型谷胱甘肽洗脫后，采用商業(yè)化的His抗體（Abmart，中國(guó)上海），進(jìn)行Western blot分析。

1.7 生物信息學(xué)及數(shù)據(jù)分析

蛋白功能 motif位點(diǎn)借助 KEGG（http://www.genome.jp/kegg/kegg2.html）數(shù)據(jù)庫(kù)分析。利用檢索得到的所有互作蛋白的氨基酸序列，以 Fasta的形式通過(guò)Kinasephos（http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/index.php）在線程序?qū)Π械鞍椎腟er和Thr磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。采用MapMan 3.6.0軟件對(duì)互作蛋白的功能及參與的代謝途徑進(jìn)行分析。通過(guò) Gene Ontology（http://geneontology.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)互作蛋白的細(xì)胞組分進(jìn)行分析。

采用Microsoft Excel 2007 整理數(shù)據(jù)和制作圖表，DPS V7.05 軟件統(tǒng)計(jì)分析，以 LSD（P＜0.05）檢驗(yàn)平均數(shù)間的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 14-3-3基因在水稻籽粒灌漿過(guò)程中的表達(dá)變化分析

采用qRT-PCR動(dòng)態(tài)分析了水稻14-3-3基因家族在花后5—30 d的基因表達(dá)變化情況。如圖1所示，除了GF14h外，其余的7個(gè)14-3-3基因家族成員在籽粒灌漿的不同時(shí)期均有表達(dá)。在整個(gè)籽粒灌漿期，GF14a的表達(dá)變化不大，GF14d的表達(dá)水平隨著灌漿的進(jìn)行逐漸下降，GF14f在花后20 d和25 d的表達(dá)水平較高，其余時(shí)期的表達(dá)水平較低。GF14c和GF14e的表達(dá)變化趨勢(shì)一致，均是在灌漿前期表達(dá)變化不大，而在花后25 d和30 d表達(dá)水平迅速上升。GF14b基因表達(dá)水平從花后10 d就開(kāi)始迅速上升。本研究進(jìn)一步選取GF14b及GF14e作為后續(xù)的研究對(duì)象。

2.2 GF14b和GF14e蛋白功能motif分析

通過(guò) KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì) GF14b和 GF14e的蛋白motif進(jìn)行比對(duì)分析（表2），發(fā)現(xiàn)GF14b和 GF14e具有 3個(gè)相同的 motif類型，分別為 pf:DUF885、pf:14-3-3和 pf:TPR_12。pf:14-3-3和 pf:TPR_12在GF14b和GF14e的氨基酸序列中所處的位置相同，而pf:DUF885所處的位置不同。此外，GF14b和GF14e也具有不同的motif類型，pf:IFT20為GF14b特有的功能motif，pf:FlaF則為GF14e特有的功能motif。

表2 GF14b 和GF14e蛋白功能motif對(duì)比Table 2 The functional motif analysis of GF14b and GF14e protein

2.3 GF14b和GF14e互作靶蛋白鑒定

本研究采用親和層析技術(shù)，篩選籽粒中與 G14b及GF14e互作的靶蛋白，并利用SDS-PAGE對(duì)親和層析獲得的蛋白樣品進(jìn)行檢測(cè)（圖2），共進(jìn)行了12次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。之后，采用 LC-MS/MS對(duì)SDS-PAGE膠上的蛋白條帶進(jìn)行鑒定。去除陰性及空白對(duì)照，選擇至少在3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)中鑒定到的蛋白作為最終結(jié)果。依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，本研究共鑒定到59個(gè)與GF14b結(jié)合的靶蛋白和72個(gè)與GF14e結(jié)合的靶蛋白，扣除2個(gè)家族成員間重復(fù)的結(jié)果，累計(jì)在籽粒中鑒定到88個(gè)與14-3-3蛋白結(jié)合的靶蛋白（表3）。

為了驗(yàn)證親和層析的結(jié)果，隨機(jī)選取2個(gè)靶蛋白（SUS3和PS）采用體外GST pull-down的方法，分別驗(yàn)證上述2個(gè)靶蛋白與GF14b及GF14e間的蛋白互作關(guān)系。構(gòu)建His-SUS3及His-PSA融合表達(dá)蛋白，誘導(dǎo)表達(dá)純化后，分別與純化后的 GST-GF14b及GST-GF14e融合表達(dá)蛋白孵育，洗脫后，采用His抗體檢測(cè)。結(jié)果表明，SUS3與GF14b和GF14e有很高的親和力，PSA僅與GF14e有相互作用條帶，證實(shí)了親和層析結(jié)果鑒定的準(zhǔn)確性（圖3）。

細(xì)胞定位分析表明，鑒定到的88個(gè)靶蛋白主要定位于細(xì)胞核（5.7%）、細(xì)胞質(zhì)（50%）、葉綠體（29.5%）、線粒體（13.6%）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（1.1%）（表3）。此外，通過(guò)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在GF14b的59個(gè)互作靶蛋白中，96.7%具有Ser或Thr磷酸化位點(diǎn)；GF14e的72個(gè)互作靶蛋白中，97.2%具有Ser或Thr磷酸化位點(diǎn)（表3）。

表3 水稻籽粒中與14-3-3家族成員GF14b和GF14e互作的靶蛋白Table 3 14-3-3 species GF14b and GF14e client proteins in developing rice grains

續(xù)表3 Continued table 3

續(xù)表3 Continued table 3

2.4 GF14b和GF14e互作靶蛋白功能分析

通過(guò)對(duì)鑒定到的88個(gè)靶蛋白的功能分析，發(fā)現(xiàn)有11.36%參與糖轉(zhuǎn)化和淀粉合成，6.82%參與光合作用，14.77%參與糖酵解，6.82%參與氨基酸代謝，18.18%參與蛋白質(zhì)合成，6.82%參與疾病和防御，6.82%參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，15.91%參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂。少部分靶蛋白與核苷酸代謝（1.14%）、TCA（2.27%）、發(fā)酵（1.14%）、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（3.41%）和C1代謝（2.27%）有關(guān)，2.27%功能未知（圖4）。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白不同家族成員間也存在著互作關(guān)系，例如GF14b 與 GF14a，GF14c，GF14d，GF14e，GF14f互作，而GF14e與GF14b，GF14c和GF14d存在互作。

2.5 GF14b與GF14e互作靶蛋白差異分析

本研究發(fā)現(xiàn)GF14b及GF14e共同互作的靶蛋白有43個(gè)，而與 GF14b特異結(jié)合的靶蛋白有 16個(gè)，與GF14e特異結(jié)合的有29個(gè)（圖5）。GF14b特異性互作蛋白主要分布于 7個(gè)功能類別，包括光合作用（2個(gè)）、核苷酸代謝（1個(gè)）、蛋白質(zhì)合成（2個(gè)）、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（3個(gè)）、疾病與防御（2個(gè)）、細(xì)胞生長(zhǎng)與分裂（4個(gè)）和未知分類（2個(gè)），而GF14e特異性互作蛋白涉及9個(gè)功能類別，包括光合作用（2個(gè)）、糖酵解（2個(gè)）、氨基酸代謝（3個(gè)）、TCA（1個(gè)）、蛋白質(zhì)合成（8個(gè)）、疾病與防御（1個(gè)）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（1個(gè)）、細(xì)胞生長(zhǎng)與分裂（9個(gè)）和C1代謝（2個(gè)）。

2.6 GF14b和GF14e及其互作靶基因?qū)ν庠醇に氐捻憫?yīng)

為了明確14-3-3蛋白在籽粒發(fā)育過(guò)程中對(duì)激素的響應(yīng)機(jī)制，運(yùn)用qRT-PCR，在轉(zhuǎn)錄水平分析了GF14b、GF14e及其互作的靶基因?qū)ν庠醇に谹BA、IAA、GA、ZT和BR的響應(yīng)。結(jié)果表明，不同外源激素處理下GF14b和GF14e基因均呈上調(diào)表達(dá)的變化趨勢(shì)，而蔗糖合成酶基因（SUS2），ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（AGPS、AGPL），丙酮酸磷酸二激酶基因（PPDK2），淀粉分支酶基因（SBE）這 5個(gè)與淀粉合成密切相關(guān)的靶基因大部分呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，僅AGPL在外源IAA的處理下呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)（圖6）。

3 討論

14-3-3蛋白是作物籽粒發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)重要的信號(hào)調(diào)節(jié)因子，例如在玉米籽粒中鑒定到的zmgf14-4和zmgf14-6[9]，在擬南芥種子中鑒定到的14-3-3χ和14-3-3ε[8]，在大麥籽粒中鑒定到的14-3-3a[27]，均在籽粒發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)水稻14-3-3基因的8個(gè)家族成員中GF14b、GF14c、GF14e、GF14f和GF14g隨著籽粒灌漿的進(jìn)行均有著不同程度的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，暗示著上述5個(gè)14-3-3基因家族成員參與到水稻籽粒灌漿充實(shí)的生理過(guò)程中。進(jìn)一步選取在籽粒灌漿期表達(dá)變化幅度較大的GF14b和GF14e，通過(guò)互作靶蛋白的鑒定，解析14-3-3蛋白在籽粒灌漿過(guò)程中的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。蛋白功能 motif分析表明，GF14b和GF14e具有3個(gè)相同類型功能motif，暗示著2個(gè)不同成員間具有相同的蛋白功能，親和層析的結(jié)果證實(shí)GF14b及GF14e間共有43個(gè)相同的互作靶蛋白。蛋白功能分析發(fā)現(xiàn)，在蔗糖轉(zhuǎn)化、淀粉合成、糖酵解代謝及TCA循環(huán)途徑中，GF14b及GF14e互作的靶蛋白大多數(shù)是一致的，例如蔗糖轉(zhuǎn)化及淀粉合成的限速酶AGPase和SuS，糖酵解過(guò)程的關(guān)鍵酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、果糖激酶（FRK）、磷酸甘油酸激酶（PGK）和 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）以及TCA循環(huán)的蘋果酸脫氫酶（MDH）。在擬南芥[8]、大麥[27]、小麥[10]及玉米[9]籽粒（種子）中也鑒定到大量與14-3-3蛋白互作的碳代謝相關(guān)靶蛋白。據(jù)此，筆者認(rèn)為水稻籽粒灌漿過(guò)程中，14-3-3蛋白家族通過(guò)與碳代謝相關(guān)靶蛋白互作，進(jìn)而參與了水稻籽粒灌漿過(guò)程中碳代謝的調(diào)控。

水稻14-3-3蛋白不同家族成員具有各自特異的調(diào)控功能，例如，GF14b與抗旱性相關(guān)[28]，GF14c被認(rèn)為是開(kāi)花的負(fù)調(diào)控因子[29]，GF14e負(fù)調(diào)控細(xì)胞死亡及抗病響應(yīng)[30]。本研究在籽粒中分別鑒定到 16個(gè)與GF14b及29個(gè)與GF14e特異結(jié)合的靶蛋白，這或許是由于2個(gè)成員間所具備的不同功能motif所導(dǎo)致的。例如，GF14b蛋白能夠特異與核酸代謝相關(guān)的Nucleoside diphosphate kinase以及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的mitochondrial carrier protein結(jié)合，而GF14e能夠與C1代謝中的 Formate dehydrogenase 1和 Formate--tetrahydrofolate ligase相互作用。此外，GF14b和GF14e在籽粒灌漿過(guò)程中的同一生理代謝過(guò)程也具有特異的調(diào)控機(jī)制，例如，在蛋白合成中，GF14e特異與40S ribosomal protein S6及Importin-alpha re-exporter結(jié)合，而 GF14b特異與 DEAD-box ATP-dependent RNA helicase結(jié)合；在細(xì)胞生長(zhǎng)分裂中，GF14b特異與ADP-ribosylation factor1結(jié)合，而 GF14e特異與Puromycin-sensitive aminopeptidase 結(jié)合。14-3-3蛋白在玉米的籽粒發(fā)育過(guò)程中也有類似的結(jié)果，玉米14-3-3蛋白ZmGF14-4在胚乳發(fā)育過(guò)程中能特異地與抗病及抗逆相關(guān)蛋白結(jié)合，而ZmGF14-6主要與代謝及細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白互作[9]。上述結(jié)果表明GF14b和GF14e通過(guò)調(diào)節(jié)各自獨(dú)有的互作靶蛋白，進(jìn)而在水稻籽粒灌漿過(guò)程中發(fā)揮著特異的調(diào)控功能。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)GF14b及GF14e不僅能夠與對(duì)方相互作用，其自身也會(huì)自我結(jié)合，說(shuō)明14-3-3蛋白家族的這2個(gè)成員間存在著蛋白二聚化（dimerization）。已有的研究也發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白能通過(guò)形成同質(zhì)或異質(zhì)二聚體[31]，從而使其能夠同時(shí)與2個(gè)靶蛋白或者1個(gè)靶蛋白的2個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域結(jié)合[32]。雖然，14-3-3蛋白主要是通過(guò)與靶蛋白互作進(jìn)而發(fā)揮其調(diào)控作用的，但GF14b及GF14e的這種自我結(jié)合及不同成員間相互結(jié)合的方式（inter- and/or intra-species bindings），或許會(huì)增強(qiáng)其在水稻籽粒灌漿過(guò)程中的調(diào)控效果。

已有研究表明，14-3-3蛋白通過(guò)參與激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而在植物發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)的過(guò)程中起到了重要的作用[3,33]。本研究發(fā)現(xiàn)，籽粒14-3-3基因家族的2個(gè)成員GF14b及GF14e均會(huì)響應(yīng)激素ABA、IAA、GA、ZT、BR的處理而出現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，說(shuō)明在籽粒灌漿過(guò)程中，14-3-3家族基因在激素信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中也發(fā)揮著重要的作用。ZHU等[34]研究發(fā)現(xiàn)在籽粒灌漿期外源噴施 ABA及乙烯能夠降低SUS、AGPase和StS基因的表達(dá)及相應(yīng)的酶活性。可見(jiàn)，植物激素會(huì)通過(guò)調(diào)控籽粒灌漿過(guò)程中淀粉合成相關(guān)酶的基因表達(dá)及活性，從而調(diào)控籽粒的灌漿充實(shí)。本研究從GF14b及GF14e共同互作靶基因中，選取了SUS2,AGPS,AGPL，PPDK2，SBE這5個(gè)與淀粉合成密切相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)上述5個(gè)靶基因在激素的處理下大部分呈下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，這與GF14b及GF14e的表達(dá)變化趨勢(shì)相反，暗示著14-3-3基因與淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的調(diào)控關(guān)系。在大麥籽粒中的研究發(fā)現(xiàn)，SuS酶的活性受外源14-3-3蛋白的抑制[27]。在擬南芥中的研究也表明，抑制14-3-3蛋白的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致淀粉的積累增加[35]。筆者前期通過(guò)RNAi干擾技術(shù)也發(fā)現(xiàn)特異減少 14-3-3家族成員的GF14f在籽粒中的表達(dá)，有利于提高籽粒灌漿過(guò)程中淀粉合成相關(guān)酶的活性[19]。據(jù)此，筆者認(rèn)為14-3-3蛋白家族在籽粒灌漿過(guò)程中會(huì)響應(yīng)激素濃度的改變，進(jìn)而對(duì)淀粉的合成起到負(fù)調(diào)控作用。

14-3-3蛋白主要是通過(guò)磷酸化作用與其互作靶蛋白結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控靶蛋白的功能，其對(duì)互作靶蛋白的結(jié)構(gòu)要求是含有磷酸化的Ser或Thr序列[2]，而本研究所鑒定到籽粒靶蛋白，大部分也是具有潛在的Ser或Thr磷酸化結(jié)合位點(diǎn)。蛋白的磷酸化修飾是調(diào)節(jié)植物碳代謝中的許多關(guān)鍵酶活性的一個(gè)重要的機(jī)制，其具體的調(diào)控過(guò)程是酶自身發(fā)生蛋白磷酸化修飾，之后與14-3-3蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，從而改變其自身的酶活性[35-36]。例如，擬南芥葉片中的StSase III家族具有保守的磷酸化位點(diǎn)（RYGSIP），使其能夠與 14-3-3蛋白結(jié)合[37]。擬南芥GAPDH磷酸化后與14-3-3蛋白結(jié)合后，其酶活性受到抑制[38]。14-3-3蛋白也主要通過(guò)磷酸化作用參與激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，14-3-3蛋白能夠與Ca2+-依賴的CDPK激酶磷酸化轉(zhuǎn)錄因子RSG（repression of shoot growth）的Ser114磷酸化位點(diǎn)結(jié)合，使得RSG滯留在細(xì)胞質(zhì)中而不能進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控編碼GA生物合成相關(guān)蛋白的基因，從而控制植株體內(nèi)GA含量[39-40]。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)水稻14-3-3蛋白自身也具有潛在的Ser或Thr磷酸化結(jié)合位點(diǎn)。前人的研究也證實(shí)14-3-3蛋白除了會(huì)與磷酸化靶蛋白結(jié)合進(jìn)而調(diào)控其活性外，其自身磷酸化作用在信號(hào)調(diào)節(jié)的過(guò)程中也起到了極為重要的作用，且不同的家族成員間的磷酸化位點(diǎn)具有特異性[41-42]。由此可見(jiàn)，14-3-3蛋白或許會(huì)通過(guò)自身磷酸化及與磷酸化后的靶蛋白結(jié)合，進(jìn)而在籽粒的碳代謝及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，但其具體的調(diào)控機(jī)制及磷酸化位點(diǎn)還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

14-3-3家族成員中的GF14b和GF14e基因在水稻籽粒灌漿過(guò)程中表達(dá)變化幅度較大，且會(huì)響應(yīng)外源激素處理而出現(xiàn)表達(dá)變化。GF14b蛋白和GF14e蛋白具有相同及各自特異的互作靶蛋白，通過(guò)磷酸化的作用方式與其靶蛋白結(jié)合，參與籽粒灌漿過(guò)程中的碳代謝及激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并作為負(fù)調(diào)控因子參與淀粉的合成過(guò)程。