德宏州油茶炭疽病拮抗內(nèi)生芽孢桿菌6715的篩選與鑒定*

周嬡婷，王芳，尹加筆 ，劉麗，張東華，洪英娣，沈德周，馬煥成，伍建榕,

(1.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護學(xué)院，云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點實驗室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，國家林業(yè)和草原局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，云南 昆明 650224；3.德宏州林業(yè)和草原局，云南 德宏 678400)

油茶(Camelliaoleifera)屬山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)[1]，是一種經(jīng)濟樹種，不僅能榨取高質(zhì)量的食用油，而且具有一定的生態(tài)價值[2]。近年來由于炭疽病的流行，導(dǎo)致油茶嚴重落花、落果、甚至整株植株死亡[3]，造成油茶產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量急劇下降。對此，化學(xué)防治是主要防治措施，進而導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、病原菌產(chǎn)生抗性、污染環(huán)境等，而生物防治因綠色、安全、高效的特點逐漸成為了化學(xué)防治的有效替代措施。所以，本文針對油茶炭疽病開展生物防治研究。

芽孢桿菌(Bacillusspp.)是目前研究最廣泛的生物防治劑，已被廣泛用于開發(fā)生物農(nóng)藥和殺真菌劑，主要是由于其次級抗微生物代謝產(chǎn)物在植物病害中發(fā)揮重要保護作用，其中脂肽類物質(zhì)就是其中之一[4]，該類物質(zhì)因具有理想特性而備受關(guān)注，如廣譜性、低毒性、抗微生物活性強等[5]。Zhu M等[6]發(fā)現(xiàn)菌株F85貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)和T113淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)對根腫病害具有顯著的抑制作用。信珊珊等[7]從水稻(Oryzasativa)根部分離到一株解淀粉芽孢桿菌，進一步研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中的脂肽類物質(zhì)引起油茶炭疽病菌絲畸形而產(chǎn)生抑制作用。本研究擬對油茶健康葉片中分離的內(nèi)生細菌進行鑒定，后通過平板對峙法篩選對油茶炭疽菌具有高效抑菌活性的拮抗細菌，并初步探討高效拮抗細菌的抑菌機制，為油茶炭疽病的綠色防治及新型生物農(nóng)藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原真菌

炭疽菌(Colletotrichumfructicola)于德宏州油茶基地感病葉片中分離得到，該菌株保存于西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護與利用學(xué)院病理學(xué)實驗室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基 1 L的培養(yǎng)基含200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，15～20 g瓊脂，121 ℃滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基 1 L的培養(yǎng)基含10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L Nacl，15～20 g瓊脂，121 ℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細菌的分離

從德宏州油茶基地采集健康葉片和果實，參考方中達[8]的方法，分離內(nèi)生細菌。材料均用自來水沖洗1 min，以去除表面雜質(zhì)，后放入75%乙醇溶液中浸泡消毒2～3 s，接著用無菌水清洗3遍，以除去殘余的乙醇溶液，最后用無菌刀片切下健康組織5 mm×5 mm的小塊，將其轉(zhuǎn)移至LB固體培養(yǎng)基中，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，用劃線法純化菌株[9]，4 ℃斜面保存。

1.2.2 內(nèi)生細菌16S rRNA序列分析

參照生工細菌試劑盒說明書進行DNA提取，然后利用細菌通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)[10]擴增16S rRNA片段，擴增的PCR產(chǎn)物送碩擎生物技術(shù)有限公司測序，所得序列在Etaxon網(wǎng)站(網(wǎng)址https://www.ezbiocloud.net/identify)比對分析。

PCR反應(yīng)體系(50 μL)：25 μL Mix，20 μL ddH2O，1 μL 27F，1 μL 1492R，3 μL DNA模板。PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性5 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸6 min，4 ℃保存。

1.2.3 內(nèi)生細菌的體外抑菌效果篩選

采用平板對峙法[11]篩選拮抗菌株。炭疽菌于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，制成直徑6 mm的菌塊，然后移至新的PDA培養(yǎng)皿中央。用待測菌株菌懸液(每片濾紙片打5 μL，OD600=0.1)點接至距離培養(yǎng)皿中央3 cm的4個位置處，無菌水處理作對照，每處理3次重復(fù)，置于26 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第4 d起每天記錄病原菌直徑，計算抑菌率[10]，抑菌率公式如下所示。

抑菌率=[(未處理病原菌直徑-處理病原菌直徑)/未處理病原菌直徑]×100%

1.2.4 抑菌效果最佳菌株在油茶離體葉片上對炭疽菌的抑制效果

經(jīng)體外平板對峙培養(yǎng)法篩選25株內(nèi)生細菌對炭疽菌的抑制效果后，選擇抑菌率最高的1株內(nèi)生細菌進行葉片回接。回接共設(shè)4個處理：(1)無菌水(對照)；(2)菌懸液；(3)炭疽菌；(4)菌懸液+炭疽菌，每處理3次重復(fù)?；亟雍笕~片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照表1。

表1 油茶葉片質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)

用無菌針刺傷葉片中央，菌懸液培養(yǎng)24 h后，均勻噴施于葉片表面，再過24 h后在刺傷位置接種直徑5 mm的病原菌塊，第4 d起每天觀察記錄，計算病情指數(shù)和發(fā)病率[12]，公式如下所示。

病情指數(shù)=[(各病級葉片數(shù)×該級代表數(shù)值)/(總?cè)~片數(shù)×最高一級代表數(shù)值)]×100

發(fā)病率=(發(fā)病葉片總數(shù)/葉片總數(shù))×100%

1.2.5 抑菌效果最佳菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定 把單菌落轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基，置搖床上28 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h。菌懸液搖勻后，取1 mL于1.5 mL離心管中，加入9 mL無菌水，用梯度稀釋法制備1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8的稀釋液。取100 μL 稀釋液涂布于LB固體培養(yǎng)基中，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征[13]。

16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析 抑菌效果最佳菌株擴增后的PCR產(chǎn)物送至碩擎生物技術(shù)有限公司測序，測得的序列在Etaxon網(wǎng)站中(網(wǎng)址https://www.ezbiocloud.net/identify)進行比對，最后用MEGA 6.0的Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

1.2.6 抑菌效果最佳菌株脂肽基因檢測

根據(jù)Farzand等[14]報道：Iturin、Bacillomycin、Fengycin、Bacillaene、Plipastatin、Bacillibactin、Surfacin和Bacylisin等脂肽類物質(zhì)具有高效的抗真菌活性。本文以效果最佳菌株的DNA為模板，擴增該菌株相應(yīng)脂肽基因，各脂肽基因特異性引物見表2。

表2 各脂肽基因引物信息

PCR反應(yīng)體系(50 μL)：25 μL Mix，18 μL ddH2O，引物各2 μL，3 μL DNA模板。PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性3 min，94 ℃變性30 s，具體退火溫度見表2，退火時間40 s，72 ℃延伸40 s，32個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及圖表制作采用Excel 2010軟件，數(shù)據(jù)顯著性分析采用SPSS Statistics 17.0進行單因素ANOVA Duncan’s多重差異顯著性分析，差異水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細菌的分離與16S rRNA序列分析

本研究共獲得25株內(nèi)生細菌，均來自健康葉片，所得菌株經(jīng)16S rRNA序列分析鑒定，結(jié)果見表3。

表3 25株內(nèi)生細菌16S rRNA序列比對結(jié)果

表3顯示：25株內(nèi)生細菌其中88%的菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。其中菌株6701、6703、6705、6707、6708、6709、6712、6714、6715、6718、6719、6720和6725的近源菌為B.tequilensisKCTC 13622，其序列相似性在99.58%～99.93%之間，占總分離菌株數(shù)的52%。菌株6702與近源菌B.megateriumNBRC 15308的相似性為99.59%，占總分離菌株數(shù)的4%。菌株6704與B.mobilis0711P9-1相似性最高，其相似性為99.1%，占總分離菌株數(shù)的4%。菌株6706與B.velezensisCR-502相似性最高，其相似性為99.21%，占總分離菌株數(shù)的4%。菌株6710與B.proteolyticusTD42相似性最高，相似性為99.59%，占總分離菌株數(shù)的4%。菌株6711和6717與近源菌B.halotoleransATCC 25096相似性最高，序列相似性為99.3%，占總分離菌株數(shù)的8%。菌株6713與S.sciuriDSM 20345相似性最高，其相似性為99.86%，占總分離菌株數(shù)的4%。菌株6716與近源菌B.siamensisKCTC 13613相似性為99.37%，占總分離菌株數(shù)的4%。菌株6721與L.adecarboxylataNBRC 102595相似性最高，相似性為99.71%，占總分離菌株數(shù)的4%。菌株6722和6723與近源菌B.zanthoxyli1433相似性最高，序列相似性在99.58%～99.65%之間，占總分離菌株數(shù)的8%。菌株6724與P.intestiniLAH16相似性最高，相似性為99.23%，占總分離菌株數(shù)的4%。

2.2 25株內(nèi)生細菌的體外抑菌效果篩選

以油茶炭疽菌為指示菌，分離得到的25株內(nèi)生細菌為待測菌株，用平板對峙法測定各待測菌株的抑菌效果，結(jié)果見圖1和圖2。由圖1可見，菌株6715的抑菌效果最好。

圖1 25株內(nèi)生細菌對油茶炭疽菌的體外抑菌作用注：開展對峙培養(yǎng)實驗的第7 d效果。Fig.1 Antagonistic activity of 25 strains isolated from healthyC.oleifera leaf against Colletotrichum fructicola in vitro

圖2 25株內(nèi)生細菌對油茶炭疽菌的抑菌率注：第7 d 25株內(nèi)生細菌對油茶炭疽菌的抑菌率結(jié)果；不同字母經(jīng)單因素ANOVA Duncan’s多重差異顯著性分析，差異水平為P<0.05。Fig.2 The inhibitory rate of 25 endophytic bacteriastrains against Colletotrichum fructicola

圖2可見菌株6715抑菌率最高(57.59%)，顯著高于其他待測菌株，占比為4%。菌株6703、6705、6706、6707、6708、6709、6711、6712、6714、6718、6719、6720和6725共13株內(nèi)生細菌抑菌率在40%～50%之間，占25株菌株總數(shù)的52%，且不同菌株間抑菌率差異不顯著。菌株6701和6717抑菌率在30%～40%之間，占比為8%。菌株6716抑菌率在20%～30%之間，占比為4%。菌株6704、6723和6724抑菌率在10%～20%之間，占比為12%。菌株6702和6713抑菌率在0～10%之間，占比為8%。菌株6710、6721和6722抑菌率在-10%～0%之間，占比為12%。

2.3 抑菌效果最好菌株6715在離體油茶葉片上對炭疽菌的抑制效果

經(jīng)體外平板對峙培養(yǎng)法篩選出菌株6715對該病原真菌的抑制效果最佳，對其進行葉片回接，各處理回接第10 d的結(jié)果見圖3、表4和圖4。

圖3 菌株6715在離體葉片上對油茶炭疽菌的抑制效果注：為葉片回接第10 d的效果，處理1、處理2、處理3、處理4分別表示無菌水(對照)(1-1，1-2，1-3)、菌懸液6715(2-1，2-2，2-3)、油茶炭疽菌(3-1，3-2，3-3)、菌懸液+油茶炭疽菌(4-1，4-2，4-3)。Fig.3 Inhibitory effects of strain 6715 againstColletotrichum fructicola on detached leaves ofC.oleifera after inoculation 10 days

表4 離體葉片病斑直徑及發(fā)病率

圖4 第10 d病斑直徑注：葉片回接第10 d數(shù)據(jù)，不同字母經(jīng)單因素ANOVA Duncan’s多重差異顯著性分析，差異水平為P<0.05。Fig.4 Effects of strain 6715 on lesion diameterafter inoculation 10 days

圖3和表4可以明顯的看出，處理1(無菌水，對照)和處理2(菌懸液6715)在整個時段內(nèi)回接的葉片均未發(fā)病，且葉片顏色均為亮綠色，說明內(nèi)生菌株6715為非致病菌?；亟拥? d時，處理3(油茶炭疽菌)，葉片均出現(xiàn)病斑，病斑較小，葉片顏色逐漸褪去，其發(fā)病率為100%，病情指數(shù)為25。同時，處理4(菌懸液6715+油茶炭疽菌)部分葉片出現(xiàn)病斑，不明顯，較為輕微，葉片顏色基本未發(fā)生變化，其發(fā)病率為44.44%，病情指數(shù)為11，顯著低于處理3(油茶炭疽菌)?；亟拥?0 d時，處理3(油茶炭疽菌)，葉片病斑明顯增大，病斑直徑為5.36 mm，顯著高于處理4(菌懸液6715+油茶炭疽菌)(圖4)，葉片顏色由亮綠色褪為黃綠色，病情指數(shù)達50，增加為第7 d處理的2倍。同時，處理4(菌懸液6715+油茶炭疽菌)葉片均出現(xiàn)病斑，病斑較小，直徑為1.84 mm，較為輕微，顯著低于處理3，葉片顏色微微褪綠，變化不大，病情指數(shù)增大到25。以上結(jié)果表明，內(nèi)生菌株6715為非致病菌，且對油茶炭疽菌有較好的抑制活性。

2.4 抑菌效果最好菌株6715的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)

菌株6715的液體培養(yǎng)單菌落，于搖床28 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)。取100 μL 1×10-6的稀釋液涂布，恒溫箱28 ℃培養(yǎng)24 h后進行革蘭氏染色，結(jié)果見圖5。

圖5 菌株6715形態(tài)特征

菌株6715培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，近圓形，菌體干燥、無粘性，表面粗糙，菌落中央有皺褶產(chǎn)生。革蘭氏染色結(jié)果表明，該菌株為陽性菌，呈棒桿狀。

2.4.2 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育聚類圖

通過對菌株6715的16S rRNA基因發(fā)育系統(tǒng)(圖6)的分析，發(fā)現(xiàn)與其相似性最高的菌株為SJ33(MG396987)，序列相似性為100%，且與B.tequilensis種的菌株聚為一支，所以，將菌株6715鑒定為B.tequilensis。

2.5 菌株6715脂肽基因檢測

由圖7可以看出，通過對菌株6715脂肽基因進行檢測發(fā)現(xiàn)，該菌株存在脂肽基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)和srfAA(200 bp)，但是脂肽基因fenD、baC、baE、bmyB、ituB均未檢測到，其中檢測到的基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)和srfAA(200 bp)分別與Bacylisin、Plipastatin和Surfacin 3種脂肽物質(zhì)相對應(yīng)。

圖6 菌株6715 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

圖7 菌株6715脂肽基因擴增結(jié)果注：M表示Marker，1，2，3，4，5，6，7，8分別是基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)、srfAA(200 bp)、fenD、baC、baE、bmyB、ituB，其中基因4，5，6，7，8未檢測到。Fig.7 Electrophoresis of biosynthesis genes for strain 6715

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本次研究從健康葉片共獲得25株內(nèi)生細菌，經(jīng)分子鑒定表明：有88%的菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。其中13株與近源菌B.tequilensisKCTC 13622的序列相似性在99.58%～99.93%之間，占總分離菌株數(shù)的52%，推測B.tequilensis為當(dāng)?shù)赜筒璁a(chǎn)區(qū)內(nèi)生細菌的優(yōu)勢類群。有學(xué)者表明，從解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)中檢測到存在促生長的植物激素IAA[15]，同時，本研究在平板對峙實驗中發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬的菌株，可能抑制或促進病原菌的生長。另外，菌株6715葉片回接抑菌效果顯示與平板對峙結(jié)果有高度的相關(guān)性，而對于該菌株盆栽活體苗的回接效果有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)菌株6715對油茶炭疽菌的抑制效果最好，抑菌率為57.59%，經(jīng)16S rRNA序列分析鑒定為B.tequilensis。據(jù)報道B.tequilensis在研究中表現(xiàn)出較好的生防應(yīng)用能力，Bhattacharya等[16]研究表明，B.tequilensis對番茄枯萎病菌鐮刀菌有高效的拮抗活性。Hui Li[17]在水稻稻瘟病(PyriculariaoryzaeCav.)研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生細菌B.tequilensis能夠顯著抑制稻瘟病病原菌的生長。Claudia Guerrero-Barajasa[18]報道了B.tequilensis能夠減輕由膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)引起的牛油果炭疽病的發(fā)生，且其對炭疽病菌的抑制率為60%。對其生防機制進行初探，發(fā)現(xiàn)菌株6715存在脂肽基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)和srfAA(200 bp)分別與Bacylisin、Plipastatin和Surfacin 3種物質(zhì)相對應(yīng)，均屬于脂肽家族。研究表明，脂肽類物質(zhì)是一類由非核糖體途徑合成的具有抗細菌和抗真菌作用屬性的生物活性分子[19]，包含Surfacin、Iturin和Fengycin 3類。研究報道脂肽類物質(zhì)主要是靠自身的兩親性和與目標(biāo)物的互作，致使靶細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變致病菌細胞膜的滲透性，進而控制致病菌的生長[20]。Surfacin是很強的表面活性劑，有研究發(fā)現(xiàn)，其與抗菌活性密切相關(guān)，能較好的抑制黃單胞桿菌(Xanthomonas)，當(dāng)缺乏合成與Surfacin相關(guān)的防御基因時，抑制效果顯著下降[21];脂肽類Bacylisin在黃瓜枯萎病[Fusariumoxysporum(Schl.) F.spcucumerinumOwen]和辣椒疫霉病(PhytophthoracapsiciLeonian)的生物防治中表現(xiàn)出良好的活性[22];脂肽類Plipastatin通過使鐮刀菌(Fusariumgraminearum)菌絲發(fā)生空泡化、菌絲纏繞凝結(jié)阻礙菌絲正常分枝，導(dǎo)致菌絲畸形，從而對病原菌表現(xiàn)出良好的拮抗活性[23]。對于菌株6715代謝物是否能有效產(chǎn)生Bacylisin、Plipastatin和Surfacin 3種脂肽物質(zhì)以及菌株6715對油茶炭疽菌的抑制作用機理，尚有待進一步研究。

3.2 結(jié)論

本次研究從健康葉片共獲得25株內(nèi)生細菌，經(jīng)分子鑒定表明：有88%的菌株屬于芽孢桿菌屬，其中B.tequilensis的分離率最高，占總分離菌株數(shù)的52%，推測B.tequilensis為當(dāng)?shù)赜筒璁a(chǎn)區(qū)內(nèi)生細菌的優(yōu)勢類群。同時，發(fā)現(xiàn)菌株6715(B.tequilensis)對油茶炭疽菌的抑制效果最好，抑菌率為57.59%。對其生防機制進行初探，發(fā)現(xiàn)菌株6715存在脂肽基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)和srfAA(200 bp)分別與Bacylisin、Plipastatin和Surfacin 3種物質(zhì)相對應(yīng)，均屬于脂肽家族。