三七總皂苷對雄激素性脫發(fā)小鼠的改善作用及機(jī)制研究

胡 俊 張敬芳 候圣祥 姚依韜 馮振國 李小溪 潘夢佳 魏 強(qiáng) 陳天禹

長沙醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，湖南長沙，410219

雄激素性脫發(fā)(androgenetic alopecia，AGA)又稱為脂溢性脫發(fā)，通常在20～35歲的男性中發(fā)病率較高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界范圍內(nèi)25歲前發(fā)病的男性患者在整個(gè)男性人群中的占比為60%，而30歲前發(fā)病的男性患者在整個(gè)男性人群中的占比為83.9%[1]，而60歲女性禿頭的發(fā)病率達(dá)50%[2]。近年來，患有AGA的人數(shù)越來越多，而且發(fā)病人群的年齡越來越小，對患者的日常生活和思想情緒等方面產(chǎn)生了較為嚴(yán)重的影響[3]。目前認(rèn)為遺傳、雄激素途徑、細(xì)胞因子等是其主要的誘因，但發(fā)病機(jī)制尚不清楚[4]。與頭皮其他部位的健康毛囊產(chǎn)生的較為結(jié)實(shí)的終毛相比，受AGA影響的毛囊會(huì)通過更小的基質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)放大細(xì)胞隔室而發(fā)生微型化改變，從而產(chǎn)生更細(xì)、色素更少的毳毛，并且逐漸發(fā)展成為永久性的，不可逆的毛囊丟失[5]。

三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)是從三七草藥加工提取得到的一種化學(xué)成分，包含了多種不同單體，例如：Rg1、Re和三七皂苷R1等[6]，具有改善心肌缺血[7]、消腫止痛、抗氧化應(yīng)激、促進(jìn)機(jī)體血液供應(yīng)[8]、抗抑郁、抗焦慮等多種功效[9]。藥理研究表明，在PNS的作用下VEGF及其特異性受體的表達(dá)得到上調(diào)，并能有效促進(jìn)血管產(chǎn)生[10]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，VEGF的表達(dá)通常在人毛囊真皮乳頭細(xì)胞和真皮鞘細(xì)胞中發(fā)生，能夠促進(jìn)毛發(fā)的生長和變粗，而對于患有AGA的患者而言，局部頭皮內(nèi)VEGF的水平明顯低于正常，甚至消失[11]。提示PNS可能通過促進(jìn)VEGF表達(dá)從而對AGA起到一定的改善作用。真皮乳頭細(xì)胞分泌的TGF-β1，對毛發(fā)循環(huán)的退行期扮演著重要角色，可引起毛囊基質(zhì)細(xì)胞凋亡，繼而引發(fā)毛囊微型化和脫發(fā)的發(fā)生，源自AGA病變部位毛乳頭細(xì)胞的雄激素誘導(dǎo)型TGF-β1是AGA中雄激素誘導(dǎo)的毛發(fā)生長抑制的原因[12]，當(dāng)TGF-β1表達(dá)水平較高時(shí)，毛發(fā)生長將會(huì)受到影響，進(jìn)而引發(fā)脫發(fā)，這是雄激素性脫發(fā)出現(xiàn)的一個(gè)非常重要的因素[13]。到目前為止暫未發(fā)現(xiàn)三七總皂苷對雄激素性脫發(fā)改善作用的研究。本課題組通過建立AGA小鼠模型，觀察三七總皂苷改善C57BL/6小鼠雄激素性脫發(fā)模型效果，探究其對AGA小鼠模型脫發(fā)區(qū)毛囊、終毛、毳毛的數(shù)目、終毛/毳毛的比值、組織中VEGF、TGF-β1表達(dá)以及血清激素、VEGF含量的影響，對其作用機(jī)制進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)選取40只雄性小鼠為研究對象，這些小鼠的體重?cái)?shù)值控制在25～27 g的范圍內(nèi)、而生長周期基本都在10周齡左右。將小鼠放到長沙醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行為期2周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，環(huán)境溫度為24℃，濕度數(shù)值為53%，人工飼料飼喂，不限食水。

1.2 主要藥品與試劑 丙酸睪酮注射液：杭州動(dòng)物藥品廠，規(guī)格：25 mg/mL，批號(hào)：190711。非那雄胺：杭州默沙東制藥公司，批號(hào)：J01305A。三七總皂苷：湖南湘雅制藥公司，批號(hào)：1905117。睪酮ELISA試劑盒：湖南歐賽德生物科技公司，批號(hào)：011A20。VEGF(批號(hào)：2155151180220)、TGF-β1(批號(hào)：229151231220)試劑盒：武漢博士德生物公司。

1.3 主要儀器 高清顯微鏡:日本奧林巴斯公司，恒溫箱：上海精宏公司，PW-812洗板機(jī)：深圳市匯松公司，SH01D離心機(jī)：上海知信實(shí)驗(yàn)儀器公司，XH-C漩渦混合器：江蘇大唐公司，移液槍、Multiskan FC酶標(biāo)儀：Thermo公司。

1.4 小鼠雄激素性脫發(fā)模型建立及分組給藥 將試驗(yàn)小鼠均等分成4組，分別是空白組、模型組、陽性組和三七皂苷組?？瞻捉M之外的3組小鼠，將5 mg/(kg·d)丙酸睪酮稀釋溶液平行于脊柱背部皮下注射，空白組實(shí)施同等劑量的注射油。同時(shí)實(shí)施對應(yīng)的用藥，陽性藥物組給予非那雄胺片0.65 mg/(kg·d)，三七總皂苷組的用藥標(biāo)準(zhǔn)為100 mg/(kg·d)，空白組和模型組選擇等體積的蒸餾水，試驗(yàn)持續(xù)60天。

1.5 觀察指標(biāo)及測定

1.5.1 小鼠一般狀態(tài)及背部毛發(fā)生長情況觀察 觀察每個(gè)時(shí)間段各組小鼠的一般狀態(tài)包括體重、活動(dòng)度等，拍照記錄小鼠肉眼觀毛發(fā)脫落情況。

1.5.2 毛囊組織病理學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)第60天取小鼠脫毛區(qū)域皮膚組織約2 cm×2 cm，用硬質(zhì)塑料板固定，防止卷曲收縮，4%多聚甲醛固定，進(jìn)行切片制作。在100倍高清顯微鏡進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)采集，包含毛囊、終毛和毳毛的生長數(shù)量。毳毛毛干短，稀薄，細(xì)小，通常沒有發(fā)髓且沒有立毛肌，延伸的深度不超過上層真皮，產(chǎn)生的軸不超過其內(nèi)根鞘。與毳毛相比終毛毛干更粗，更長，色素深[14]。每個(gè)切片選取三個(gè)沒有重疊的視野，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5.3 小鼠血清VEGF、睪酮含量的測定 持續(xù)用藥60天后，從試驗(yàn)小鼠的眼球部位采血，將采集到的血液放到高速離心機(jī)中按照轉(zhuǎn)動(dòng)速度3000 r/min進(jìn)行10 min的離心操作，將血液中的血清完全分離出來，之后使用試劑盒完成血清中睪酮和VEGF的濃度數(shù)據(jù)檢測。

1.5.4 皮膚組織VEGF、TGF-β含量測定 給藥60天后，選取小鼠脫毛部位的皮膚，將剩余的毛發(fā)處理干凈，將其制成濃度為10%的組織勻漿，使用試劑盒完成其中VEGF、TGF-β1的濃度檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 Excel錄入數(shù)據(jù)，使用Graphpad 9.0處理分析，用單因素方差分析檢驗(yàn)顯著性，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài)及脫發(fā)情況的觀察結(jié)果 實(shí)驗(yàn)過程中所有的小鼠正常攝入食物和水分，除空白組外，其余各組體重在正常范圍內(nèi)稍有下降。在小鼠背部皮下注射丙酸睪酮后，出現(xiàn)明顯的廝打現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)第25天左右毛發(fā)失去原有的光澤，35天左右毛發(fā)逐漸脫落。用藥60天后，繼續(xù)觀察小鼠背部脫毛區(qū)，未見表皮的局限性淺表缺損、水腫等異常表現(xiàn)(圖1)。模型組小鼠背部毛發(fā)脫落減少，毛發(fā)稀疏，背部脫發(fā)區(qū)域廣呈灰白色；空白組毛發(fā)有光澤、覆蓋完全；陽性組脫發(fā)區(qū)域毛發(fā)覆蓋較完全，基本呈黑色接近于空白組；三七總皂苷組較模型組脫發(fā)區(qū)縮小域呈灰黑色，可見大量新生毛發(fā)，其作用趨勢開始逐步接近陽性組。

2.2 三七總皂苷對小鼠背部毛囊數(shù)量及終毛/毳毛比值的影響 病理切片、毛囊計(jì)數(shù)結(jié)果表明，空白組毛囊分布均勻，可見大量毛干粗毛干色素深的終毛；模型組毛囊少分布稀疏，且多為毛干細(xì)毛干色素淺的毳毛；陽性組毛囊數(shù)目多接近正常組；三七總皂苷組毛囊較模型組毛囊數(shù)目增多，且多為毛干粗毛干色素深的終毛。相比空白組的小鼠，模型組皮膚總毛囊、終毛數(shù)量都有了很大程度的降低(P<0.01)，終毛/毳毛占比數(shù)值大幅度減小(P<0.01)，這表明試驗(yàn)的模型是成立的。相比模型組而言，陽性組小鼠皮膚毛囊數(shù)目、終毛毛囊數(shù)目以及終毛/毳毛比值顯著增加(P<0.01)；三七總皂苷組小鼠皮膚毛囊數(shù)目、終毛毛囊數(shù)目明顯增加(P<0.01)，終毛/毳毛比值也有所增加(P<0.05)，說明這兩種藥物能增加小鼠毛囊的數(shù)量，來達(dá)到改善小鼠雄激素性脫發(fā)的效果。三七總皂苷組毛囊數(shù)目較陽性組有一定差距，但是有逐漸接近的趨勢(圖2、3)。

2.3 三七總皂苷對小鼠血清睪酮，VEGF含量的影響 相比空白組而言，模型組睪酮在血清中的濃度數(shù)值顯著提升(P<0.01)，血清VEGF含量明顯下降(P<0.01)，提示造模成功。相比模型組而言，陽性組血清睪酮的濃度數(shù)值明顯減小(P<0.01)，血清VEGF的濃度數(shù)值并沒有出現(xiàn)較大幅度的增大(P>0.05)。三七總皂苷組小鼠血清睪酮含量較模型組無明顯變化(P>0.05)，高于陽性組。三七總皂苷組血清VEGF含量較模型組、陽性組明顯升高(P<0.01)，與空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4)。

1a：空白組小鼠毛發(fā)密集有光澤；1b：模型組小鼠毛發(fā)脫落，融合成片；1c：陽性組毛發(fā)覆蓋較完全；1d：三七總皂苷組較模型組小鼠毛發(fā)密集可見大量新生絨毛

2a：空白組毛囊數(shù)目多分布密集；2b：模型組毛囊數(shù)目明顯減少稀疏；2c、2d：陽性組、三七總皂苷組較模型組毛囊數(shù)目顯著增多且分布更加廣泛，可見較多的毛干色深直徑大的生長期毛囊(HE，×100)

圖3 3a～3d:三七總皂苷對小鼠總毛囊數(shù)目、終毛毛囊數(shù)目、毳毛毛囊數(shù)目、終毛/毳毛毛囊數(shù)目的影響*P<0.05,***P<0.001

圖4 4a、4b:三七總皂苷對小鼠血清睪酮、VEGF表達(dá)影響*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001 圖5 5a、5b:三七總皂苷對小鼠皮膚組織中VEGF、TGF-β1表達(dá)影響*P<0.05,***P<0.001

2.4 三七總皂苷對小鼠皮膚組織中VEGF、TGF-β含量的影響 相比空白組而言，模型組皮膚組織含有的VEGF濃度數(shù)值明顯減少(P<0.01)，TGF-β1濃度數(shù)值明顯增大(P<0.01)；相比模型組而言，三七總皂苷組和陽性組對應(yīng)的VEGF濃度數(shù)值明顯增大(P<0.01)，其中三七總皂苷組皮膚組織中VEGF表達(dá)量上升的幅度較陽性組更加顯著(P<0.01)。與模型組相比三七總皂苷組和陽性組皮膚組織中TGF-β1的表達(dá)量下降(P<0.01，P<0.05)，三七總皂苷與陽性組基本接近(圖5)。

3 討論

AGA也稱為男性型脫發(fā)，是一種常見的慢性皮膚疾病。通過5a-還原酶II型將睪酮轉(zhuǎn)化為二氫睪酮，以及在遺傳易感性毛囊的真皮乳頭內(nèi)存在雄激素受體來介導(dǎo)[15]。最新研究顯示因嚴(yán)重新冠肺炎感染而住院的男性，與相同人群的預(yù)期相比，雄激素性脫發(fā)的發(fā)生率非常高[16]，可能與雄激素受體信號(hào)傳導(dǎo)可導(dǎo)致跨膜絲氨酸蛋白酶2的表達(dá)與關(guān)[17]，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確。

AGA與各種生長因子的調(diào)節(jié)，以及局部血液循環(huán)等有關(guān)。在毛發(fā)周期的生長期毛囊周圍血管形成顯著增加，毛囊外圍的血管量增多與其外根鞘角質(zhì)形成細(xì)胞VEGF表達(dá)水平增強(qiáng)有著較為密切的關(guān)聯(lián)。VEGF在毛囊外根鞘角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平過高，能夠提升毛發(fā)的生長速度以及毛囊和毛干的相關(guān)數(shù)值[18]。“發(fā)為血之余”，解決脫發(fā)的有效手段通常有兩種，一種是保證毛囊獲取更多的養(yǎng)分，另一種就是使其微循環(huán)環(huán)境更加理想，真皮乳頭細(xì)胞釋放出的VEGF能夠促進(jìn)機(jī)體形成更多的毛細(xì)血管，保證血管量增多[19]，對毛囊起到營養(yǎng)作用[20]。而當(dāng)微循環(huán)灌注的紊亂導(dǎo)致血液循環(huán)中血液灌注速度和流量的降低，從而影響到頭皮毛囊的正常氧氣供應(yīng)，導(dǎo)致脫發(fā)[21]。經(jīng)過睪酮轉(zhuǎn)化而來的二氫睪酮誘導(dǎo)毛乳頭細(xì)胞TGF-β1抑制毛囊上皮細(xì)胞生長[22]。當(dāng)TGF-β1的表達(dá)下調(diào)時(shí)可通過維持毛囊的退行期和毛囊細(xì)胞的活力來防止脫發(fā)[23]。

目前國內(nèi)治療男性雄激素性脫發(fā)的主要藥物有非那雄胺口服和米諾地爾溶液外用，有些患者因?yàn)槠洚a(chǎn)生的不良反應(yīng)拒絕治療[24]。而部分中藥治療脫發(fā)類疾病有確切療效，三七總皂苷能夠有效促進(jìn)血流供應(yīng)，有較強(qiáng)改善微循環(huán)的作用[8]，且口服不良反應(yīng)發(fā)生率極低，主要集中在過敏反應(yīng)、消化道反應(yīng)，一般癥狀較輕，停藥后多數(shù)癥狀消失[25]，價(jià)格實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)。因此該研究選擇中藥單體三七總皂苷作為研究對象，通過實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步了解其臨床療效和作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)選取C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，采用背部皮下注射丙酸睪酮溶液建立AGA鼠類模型，基本和AGA的病理現(xiàn)象是一致的。觀察記錄小鼠在用藥后毛發(fā)的生長狀況、各種狀態(tài)下的毛囊計(jì)數(shù)、血清中睪酮VEGF含量及皮膚組織中VEGF、TGF-β1表達(dá)量。

在實(shí)驗(yàn)過程中，將C57BL/6小鼠背部皮下多點(diǎn)注射6周丙酸睪酮后，有明顯的毛發(fā)脫落現(xiàn)象，模型組小鼠體內(nèi)激素水平失衡、肉眼可見的毛發(fā)減少以及皮膚病理切片顯示的毛囊數(shù)目明顯減少，說明AGA小鼠模型建立成功。模型組小鼠皮膚中TGF-β1表達(dá)量明顯升高，這與胡嘉元等[26]在實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果有所不同，分析原因可能與實(shí)驗(yàn)小鼠品種等因素有關(guān)。除空白組外各組均出現(xiàn)了不同程度的好斗、易激惹，這可能與造模時(shí)背部皮下注射丙酸睪酮引起小鼠體內(nèi)雄激素增高有關(guān)。研究結(jié)果顯示在用藥60 d后，三七總皂苷組小鼠與模型組相比，外觀上毛發(fā)更有光澤，脫發(fā)面積有所減小，脫發(fā)區(qū)域的皮膚顏色加深，組織病理學(xué)切片顯示皮膚毛囊數(shù)目、終毛毛囊數(shù)量顯著增多(P<0.01)，終毛/毳毛的占比數(shù)值也相對增大(P<0.05)，說明三七總皂苷可以改善AGA模型小鼠的微型化。三七總皂苷組相比模型組和陽性組，血清含有的VEGF濃度數(shù)值明顯增大(P<0.01)，而且皮膚組織含有的VEGF濃度數(shù)值增大(P<0.01)，可能與給予三七總皂苷后對小鼠局部組織微循環(huán)改善以及全身血液循環(huán)的促進(jìn)有關(guān)。而TGF-β1含量降低(P<0.05)，所以三七皂苷對小鼠脫發(fā)起到一定的預(yù)防和改善作用。除陽性組外，其他使用藥物的小鼠血清含有的睪酮濃度數(shù)值和模型組的數(shù)值較為接近，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異較小，說明三七總皂苷對AGA小鼠血清睪酮濃度無明顯影響，而使用非那雄胺藥物的小鼠血清含有的睪酮濃度數(shù)值明顯要比模型組更低(P<0.01)，這和其作用機(jī)理是相同的。雖然從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看三七總皂苷的療效與陽性藥物組有一定差距，但是三七總皂苷組小鼠血清中VEGF含量和小鼠皮膚組織中VEGF的表達(dá)量明顯高于陽性組，因此說明三七總皂苷較非那雄胺有較強(qiáng)的微循環(huán)改善作用，從而對AGA起到一定的改善，加上三七總皂苷能有效降低皮膚組織中TGF-β1的表達(dá)對AGA小鼠脫發(fā)其有一定的預(yù)防作用，而且其不良反應(yīng)少，發(fā)生率低，因此說明三七總皂苷可作為一種預(yù)防和改善AGA發(fā)生的藥物。我們期待三七總皂苷能否與非那雄胺等一線用藥聯(lián)合用藥來進(jìn)一步提高AGA治療效果，則需要進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)三七總皂苷對C57BL/6雄激素性脫發(fā)模型小鼠脫發(fā)有一定預(yù)防和改善作用，且在實(shí)驗(yàn)過程中未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用。其作用機(jī)制可能與上調(diào)小鼠皮膚組織和血液中VEGF的表達(dá)，下調(diào)小鼠皮膚組織中TGF-β1表達(dá)相關(guān)。