BIR2選擇性凋亡抑制蛋白抑制劑研究進(jìn)展

王逸博，孫海鷹

（中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)系，江蘇省藥物分子設(shè)計(jì)與成藥性優(yōu)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

1 凋亡抑制蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）是一類高度保守的內(nèi)源性抑制細(xì)胞凋亡的蛋白家族，在昆蟲、酵母和哺乳動(dòng)物等中廣泛存在[1]。目前在人體中發(fā)現(xiàn)的IAPs共有8種，包括NIAP、c-IAP1、c-IAP2、XIAP、Survivin、BRUCE、MLIAP和ILP2[2]。IAPs蛋白家族的結(jié)構(gòu)特征是氮端含有1 ～ 3個(gè)包含70個(gè)氨基酸的桿狀病毒IAP重復(fù)序列（baculoviral IAP repeat，BIR)，即BIR結(jié)構(gòu)域。BIR結(jié)構(gòu)域是絕大多數(shù)IAPs的抗凋亡活性所必須的，不同BIR結(jié)構(gòu)域具有一定的同源性，但功能卻各不相同[3]。IAPs主要通過直接或間接地抑制半胱天冬酶（Caspases）的活性或參與調(diào)節(jié)核因子κB（NF-κB）的功能來抑制細(xì)胞凋亡，抑制IAPs可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或增加細(xì)胞死亡的閾值[4]。在IAPs中被研究最多的是XIAP、c-IAP1和c-IAP2，它們均含有3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域（見圖1）。XIAP的BIR3結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合并抑制Caspase-9，而XIAP的BIR2結(jié)構(gòu)域和BIR1與BIR2之間的肽鏈可以結(jié)合并抑制 Caspase-3和 Caspase-7[5]。c-IAP1和 c-IAP2也可以通過它們的BIR3結(jié)構(gòu)域與Caspase-9結(jié)合，但不能抑制Caspase-9的活性，它們主要通過抑制Caspase-8的激活來抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[6-8]。XIAP、c-IAP1和c-IAP2在很多腫瘤中過度表達(dá)，而且其過度表達(dá)與腫瘤的發(fā)展和抗藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)，因此它們被認(rèn)為是研發(fā)新型抗腫瘤藥物的 靶點(diǎn)[9-12]。

2 Smac的功能及其與IAPs的相互作用

Smac是線粒體接收到凋亡信號(hào)后釋放出的一種蛋白，它是細(xì)胞中IAPs的內(nèi)在調(diào)節(jié)劑。Smac可以通過其氮端的四肽AVPI（Ala-Val-Pro-Ile）與IAPs的BIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，因此Smac氮端的四肽AVPI被稱為IAP結(jié)合單元（IAP binding motif，IBM）。當(dāng)Smac與XIAP結(jié)合時(shí)先形成二聚體，二聚體中的2個(gè)AVPI四肽單元分別與XIAP的BIR2和BIR3結(jié)合。Smac與XIAP的結(jié)合可以直接抑制XIAP與Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的結(jié)合，從而恢復(fù)Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的功能，促使凋亡發(fā)生。當(dāng)Smac與c-IAP1和c-IAP2結(jié)合時(shí)只與這2種IAPs的BIR3結(jié)合。Smac與c-IAP1和c-IAP2結(jié)合后會(huì)誘導(dǎo)它們降解，從而間接促使Caspase-8的激活[9-12]。

目前已有多個(gè)以XIAP、c-IAP1和c-IAP2為靶點(diǎn)的小分子IAPs抑制劑進(jìn)入臨床研究，其中大部分都是以四肽AVPI為先導(dǎo)化合物設(shè)計(jì)的BIR3選擇性泛IAPs抑制劑，即這些化合物可以與XIAP、c-IAP1和c-IAP2的BIR3結(jié)構(gòu)域有效結(jié)合[13]。另外，基于BIR3選擇性IAPs抑制劑已有很多報(bào)道，其中部分化合物已經(jīng)進(jìn)入臨床研究[13-14]。對(duì)BIR2選擇性IAPs抑制劑的研究相對(duì)較少，但近年來隨著對(duì)IAPs作用機(jī)制的深入研究，對(duì)BIR2選擇性IAPs抑制劑的研究也引起了越來越多藥物化學(xué)家們的關(guān)注。BIR2選擇性IAPs抑制劑可以阻斷XIAP與Caspase-3和Caspase-7 的相互作用，但不會(huì)使c-IAP1和c-IAP2 降解，也不會(huì)引起因c-IAP1和c-IAP2降解導(dǎo)致的非經(jīng)典NF-κB通路的激活，其功能與BIR3選擇性IAPs抑制劑完全不同，因此是一類新型的IAPs抑制劑，不僅可以作為藥物進(jìn)行研發(fā)，也可以作為小分子工具用于相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制研究。

3 BIR2選擇性IAPs抑制劑

3.1 早期通過高通量篩選得到的BIR2選擇性IAPs抑制劑

對(duì)BIR2選擇性的XIAP抑制劑的研究最早可追溯至2003年。Tamm等[15]利用噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)一個(gè)通過二硫鍵環(huán)合的六肽CEFESC（Cys-Glu-Phe-Glu-Ser-Cys）可以特異性地與XIAP的BIR2結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，但跟其他IAPs沒有結(jié)合作用。Caspase-3和Caspase-7可抑制該六肽CEFESC與XIAP的結(jié)合，但Caspase-8不具備該功能，表明該六肽是靶向XIAP中與Caspase-3和Caspase-7結(jié)合的區(qū)域，但該六肽與XIAP的具體結(jié)合模式尚不清楚。

2003年Wu等[16]通過高通量篩選的方法對(duì)一個(gè)包含160 000個(gè)小分子化合物的化合物庫(kù)進(jìn)行了篩選，成功發(fā)現(xiàn)了一系列非肽類的小分子磺酰胺類化合物，這類化合物通過與XIAP中的linker-BIR2區(qū)域結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地解除XIAP對(duì)Caspase-3的抑制作用，其中化合物1結(jié)合的IC50為10 μmol·L-1。這類化合物可以誘導(dǎo)293細(xì)胞系的凋亡，并且增強(qiáng)CD95和腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL）誘導(dǎo)凋亡的能力。

2004年Shimmer等[17]通過對(duì)包含近1×108個(gè)肽類及非肽類化合物的化合物庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，發(fā)現(xiàn)了一系列多苯基脲類BIR2選擇性XIAP抑制劑，其中活性最強(qiáng)的是化合物2。該化合物可以特異性與XIAP的BIR2結(jié)構(gòu)域結(jié)合并恢復(fù)Caspase-3的活性，而且可以直接誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡。在異種移植的小鼠模型中該化合物可以抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)并增加腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性。

3.2 以多肽為先導(dǎo)化合物設(shè)計(jì)的BIR2選擇性IAPs抑制劑

雖然以往研究中通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)了一些BIR2選擇性XIAP抑制劑，但這些化合物與XIAP-BIR2的結(jié)合能力通常不強(qiáng)，而且結(jié)合模式也不確定，因此多個(gè)課題組采用與BIR3選擇性IAPs抑制劑的研發(fā)中類似的方式，以Smac氮端的四肽AVPI為先導(dǎo)化合物，對(duì)BIR2選擇性IAPs抑制劑進(jìn)行研究。

四肽AVPI既可以與XIAP的BIR2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，也可以與XIAP的BIR3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，但它與BIR3的結(jié)合能力強(qiáng)于與BIR2的結(jié)合能力。2006年Sweeney等[18]用不同的天然氨基酸對(duì)AVPI中各個(gè)位置的氨基酸分別進(jìn)行替換，合成了一系列四肽，并研究了四肽與XIAP的BIR2結(jié)構(gòu)域結(jié)合的構(gòu)效關(guān)系。結(jié)果表明，為了保持與XIAP-BIR2的結(jié)合能力，P1位置只能選Ala；P2位置傾向于β位帶有支鏈的疏水性氨基酸，如Val、Thr、Ile等，或者是既含有疏水性，又含有親水性片段的氨基酸，如Gln、Glu、Lys、Arg、Tyr等；P3位置傾向于含有小的側(cè)鏈的氨基酸，如Ala、Ser、Val等；P4位置也傾向于帶有較小側(cè)鏈的氨基酸，如Gly、Ala、Thr、Val等。

2013年Lukacs等[19]對(duì)Sweeney等[18]的研究結(jié)果進(jìn)行了確證，發(fā)現(xiàn)與BIR2結(jié)合能力最強(qiáng)且選擇性最高的四肽是ATAA（Ala-Thr-Ala-Ala），該四肽ATAA與XIAP的BIR2結(jié)合的抑制常數(shù)Ki為1.7 μmol·L-1，比 Smac 氮 端 的 四肽 AVPI與 XIAP 的BIR2 的結(jié)合能力強(qiáng) 3 倍（Ki= 5.2 μmol·L-1）。更重要的是，Lukacs等[19]還解析了5個(gè)四肽與XIAP的BIR2形成的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，分別是ATAA 復(fù)合物（PDB ID：4j45）、AIAV 復(fù)合物（PDB ID：4j44）、AVPI 復(fù)合物（PDB ID：4j46）、SVPI 復(fù)合 物（PDB ID：4j47） 和AMRV 復(fù) 合 物（PDB ID：4j48），從而從結(jié)構(gòu)生物學(xué)的角度證實(shí)了這些四肽與XIAP的BIR2結(jié)構(gòu)域的結(jié)合模式。雖然這些四肽與XIAP-BIR2的結(jié)合能力有差異，但它們與XIAP-BIR2的結(jié)合模式基本一致。比較AVPI與XIAP-BIR2和XIAP-BIR3形成的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，BIR2和BIR3中3個(gè)關(guān)鍵位置的氨基酸殘基的不同顯著影響了它們與四肽的結(jié)合，這3個(gè)位置的氨基酸殘基分別是His223/Trp323、Phe224/Tyr324和Lys206+Lys208/Gly306+Thr308（見圖2）。四肽中P3位置的氨基酸殘基可以與His223/Trp323和Phe224/Tyr324結(jié)合。His223中的側(cè)鏈比Trp323中的側(cè)鏈小，因此BIR2與四肽中P3位置的氨基酸殘基的疏水性作用弱于BIR3。同樣因?yàn)镠is223中的側(cè)鏈小于Trp323，His323與Phe224之間的空腔比Trp223與Tyr324間的空腔大，而且Tyr324中的羥基可以與BIR3中的Gly306的羰基形成氫鍵，使蛋白構(gòu)象具有更強(qiáng)的剛性，所以與BIR2結(jié)合時(shí)四肽的P3位置可以是較大的不同基團(tuán)，而與BIR3結(jié)合時(shí)P3位置只能是Pro。在XIAP-BIR2中Lys206和Lys208的側(cè)鏈及其下方的Gln197的側(cè)鏈形成了一個(gè)較淺的口袋與四肽中P4位置的氨基酸殘基的側(cè)鏈結(jié)合，而在XIAP-BIR3中對(duì)應(yīng)于Lys206和Lys208的分別是Gly306和Thr308，這2個(gè)殘基與P4位置的氨基酸側(cè)鏈結(jié)合較弱，P4位置的氨基酸側(cè)鏈主要是與其下方由Lys297、Lys299及Leu292形成的一個(gè)較大的疏水性口袋結(jié)合，因此XIAP-BIR3中與P4位置結(jié)合的疏水性空腔較大，可以容納較大的疏水性氨基酸側(cè)鏈。這些結(jié)構(gòu)信息為設(shè)計(jì)選擇性IAPs抑制劑奠定了基礎(chǔ)。

圖2 AVPI與XIAP-BIR2（A）和XIAP-BIR3（B）的結(jié)合模式[19]Figure 2 Binding modes of AVPI with XIAP-BIR2 (A)and XIAP-BIR3 (B)

2011年Cosford課題組發(fā)現(xiàn)將AVPI四肽中的Ile殘基用芳基取代可以提高化合物對(duì)BIR2的結(jié)合能力，其中選擇性最高的化合物3與XIAP的BIR2結(jié) 合 的Ki為 0.74 μmol·L-1，是該 化合物與 XIAP的 BIR3 結(jié)合能力的 7 倍（Ki= 5.5 μmol·L-1）[20]。Cosford課題組在這類化合物中用氮甲基丙氨酸替換了AVPI中的Ala，因?yàn)橐郧霸贐IR3選擇性的化合物的研究中發(fā)現(xiàn)在Ala的氨基上引入甲基不會(huì)影響化合物的蛋白結(jié)合能力，但可以顯著提高化合物的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，可能是因?yàn)橐爰谆罂梢蕴岣呒?xì)胞穿透性。細(xì)胞活性研究表明，這類化合物在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中可以增強(qiáng)TRAIL引起凋亡的能力。在上述研究的基礎(chǔ)上，Cosford課題組對(duì)該類化合物的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了進(jìn)一步的探索，發(fā)現(xiàn)用Ala替換Pro可以進(jìn)一步地提高選擇性，其中選擇性最優(yōu)的化合物4與XIAP的BIR2的結(jié)合能力是其與XIAP的BIR3的結(jié)合能力的 70 倍（Ki：0.64 μmol·L-1vs40.15 μmol·L-1）；與化合物3類似，化合物4單一給藥并未顯示出抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，但同樣能使細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡更加敏感[21]。

2014年羅氏公司公開了2項(xiàng)擬肽類的BIR2選擇性IAPs抑制劑的專利，發(fā)現(xiàn)用芳環(huán)與AVPI衍生物中Pro的五元環(huán)并環(huán)后可以顯著提高化合物與BIR2的結(jié)合能力和選擇性，其中代表性的化合物5與XIAPBIR2 和 XIAP-BIR3 結(jié)合的 IC50分別為 0.013 μmol·L-1和大于 55 μmol·L-1，化合物 6 與 XIAP- BIR2 和XIAP-BIR3 結(jié)合的 IC50分別為 0.010 μmol·L-1和大于55 μmol·L-1[22-23]。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了以四肽為先導(dǎo)化合物研發(fā)BIR2選擇性IAPs抑制劑的可行性。

3.3 經(jīng)過高通量篩選并優(yōu)化得到的新型BIR2選擇性IAPs抑制劑

2013年Andrew課題組報(bào)道了一類新型的苯并西平類和苯并二氮雜?類BIR2選擇性IAPs抑制劑[24-25]。該課題組首先通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)了一個(gè)具有一定的BIR2選擇性且相對(duì)分子質(zhì)量與親脂性均較低的化合物7，隨后以化合物7為先導(dǎo)化合物進(jìn)行了詳細(xì)的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，合成了一系列BIR2選擇性小分子IAPs抑制劑，顯著提高了化合物的蛋白結(jié)合能力和選擇性，并改善了藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，其中代表性的化合物8與XIAP-BIR2結(jié)合的IC50為 39 nmol·L-1，與 XIAP-BIR3 結(jié)合的 IC50為3.06 μmol·L-1。與其選擇性結(jié)合并抑制 XIAP-BIR2的活性一致，化合物8在體內(nèi)和體外均可以有效阻斷XIAP與Caspase-3和Caspase-7的相互作用，而且不會(huì)引起c-IAP1/2的降解，表明化合物8并不能與c-IAP1/2的BIR3結(jié)構(gòu)域有效結(jié)合。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，化合物8對(duì)細(xì)胞色素P4503A4酶（CYP3A4）具有很強(qiáng)的抑制作用（IC50= 1.8 μmol·L-1），因此不能用于進(jìn)一步的臨床研究。為了進(jìn)一步改善成藥性，該課題組在化合物8的基礎(chǔ)上進(jìn)行了進(jìn)一步廣泛且細(xì)致的優(yōu)化，在保持與XIAP-BIR2的結(jié)合能力及選擇性的同時(shí)，進(jìn)一步改善了化合物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，并顯著降低了化合物對(duì)CYP3A4的抑制，其中最優(yōu)的化合物9抑制XIAP-BIR2和XIAP-BIR3的Ki分別為45 nmol·L-1和 30.8 μmol·L-1?；衔?9 抑制 CYP3A4的 IC50是 16 μmol·L-1，與化合物 8 相比顯著降低。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，化合物9具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和安全性，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中化合物9與DR5抗體conatumummab聯(lián)合用藥時(shí)可以有效增強(qiáng)Caspase-3和Caspase-7的活性。另外在機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，化合物9在作用過程中沒有激活非經(jīng)典的NF-κB通路，表明該化合物不會(huì)有效抑制c-IAP1/2的活性。

4 結(jié)語與展望

細(xì)胞凋亡是癌癥的主要特征之一，在細(xì)胞凋亡中有重要功能的蛋白很多都是抗腫瘤新藥研發(fā)的重要靶點(diǎn)。IAPs是細(xì)胞凋亡中的逆向調(diào)節(jié)劑，已有多個(gè)靶向IAPs的BIR3結(jié)構(gòu)域的小分子化合物和基于BIR3選擇性IAPs抑制劑設(shè)計(jì)的二聚體IAPs抑制劑進(jìn)入臨床研究。不同于廣受關(guān)注的BIR3選擇性IAPs抑制劑，BIR2選擇性IAPs抑制劑有其獨(dú)特的功能。BIR2選擇性IAPs抑制劑可以阻斷XIAP與Caspase-3和Caspase-7的相互作用，并促進(jìn)多種抗腫瘤藥物的抗腫瘤效果，但不會(huì)引起c-IAP1和c-IAP2的降解，因此對(duì)BIR2選擇性IAPs抑制劑的作用機(jī)制進(jìn)行研究，可以進(jìn)一步闡明XIAP、c-IAP1和c-IAP2的生物學(xué)功能，并促進(jìn)以IAPs為靶點(diǎn)的新藥研發(fā)。筆者所在課題組近年來一直在從事新型IAPs抑制劑的研發(fā)工作，近期工作集中于BIR2選擇性IAPs抑制劑的設(shè)計(jì)、合成及生物活性研究，并探索BIR2選擇性IAPs抑制劑的進(jìn)一步利用。

在已報(bào)道的IAPs抑制劑中，最初研發(fā)二聚體IAPs抑制劑的目的是發(fā)展出能夠模擬二聚的Smac蛋白的功能，同時(shí)與XIAP的BIR2和BIR3更有效結(jié)合的XIAP抑制劑，但已報(bào)道的二聚體IAPs抑制劑實(shí)際上都是基于BIR3選擇性IAPs抑制劑設(shè)計(jì)的，利用BIR2選擇性的化合物與BIR3選擇性的化合物有可能設(shè)計(jì)出更有效的二聚體XIAP抑制劑。另外，已報(bào)道的二聚體IAPs抑制劑的抗腫瘤活性比BIR3選擇性的單體IAPs抑制劑強(qiáng)100倍以上，而它們與XIAP的結(jié)合能力也比單體IAPs抑制劑強(qiáng)100倍以上；但有研究表明，IAPs抑制劑的抗腫瘤活性并不依賴于對(duì)XIAP的抑制，對(duì)其具體作用機(jī)制尚不清楚。因此，通過設(shè)計(jì)BIR2選擇性IAPs抑制劑和BIR3選擇性IAPs抑制劑組成的新型二聚體IAPs抑制劑，有可能進(jìn)一步闡明二聚體IAPs抑制劑的作用機(jī)制，而且可以促進(jìn)二聚體IAPs抑制劑在新藥研發(fā)中的應(yīng)用。

近年來，對(duì)蛋白降解靶向嵌合體（PROTACs）的研究已成為藥物化學(xué)研究中的熱點(diǎn)之一。PROTACs是由與靶蛋白結(jié)合的配體和與E3泛素連接酶結(jié)合的配體通過連接鏈連接而成的一類嵌合分子，可以同時(shí)與靶蛋白和E3泛素連接酶結(jié)合，促進(jìn)靶蛋白的泛素化，使靶蛋白被蛋白酶體降解。XIAP、c-IAP1和c-IAP2均具有E3泛素連接酶的功能，因此IAPs抑制劑可被用于PROTACs的研發(fā)，但BIR3選擇性IAPs抑制劑可以誘導(dǎo)c-IAP1和c-IAP2的快速降解，因此嚴(yán)重限制了它們?cè)赑ROTACs研發(fā)中的利用。BIR2選擇性IAPs抑制劑不會(huì)引起c-IAP1和c-IAP2的降解，因此有可能在基于IAPs的PROTACs的研發(fā)中得到應(yīng)用。

最后，選擇性地作用于cIAP1和cIAP2的小分子化合物已有報(bào)道，但選擇性地作用于XIAP的小分子化合物一直未能發(fā)現(xiàn)。以前的研究結(jié)果表明，BIR2選擇性IAPs抑制劑對(duì)XIAP-BIR2有較高的選擇性，因此有可能利用對(duì)XIAP-BIR2有較高選擇性的化合物設(shè)計(jì)選擇性降解XIAP的PROTACs，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)XIAP的選擇性抑制。這類化合物在闡明不同的IAPs家族蛋白的生物學(xué)功能方面將會(huì)有廣泛的應(yīng)用。

綜上所述，BIR2選擇性IAPs抑制劑是一類新型的IAPs抑制劑，不僅可以用于以IAPs為靶點(diǎn)的新藥研發(fā)，而且可以用于IAPs的生物學(xué)作用機(jī)制的研究中。