不同冬瓜品種對疫病的抗性與根際土壤微生物數(shù)量的關系

陳康麗 曾莉莎 周海琪 王芳 吳永官 唐琪璐 王益奎 杜彩嫻 黎炎

摘? ? 要：為了給不同冬瓜品種的疫病抗性評價及其生物防治機制提供依據(jù)，研究了不同抗性冬瓜品種的根際微生物群落數(shù)量及功能多樣性的差異。以不同冬瓜品種為材料，采用自然病圃法調查不同冬瓜品種田間疫病抗病性，并采用葉碟誘導計數(shù)法和平板稀釋計數(shù)法調查不同品種的根際微生物的多樣性。結果表明，冬瓜品種之間的病情指數(shù)表現(xiàn)為：綠寶極早熟>小家碧玉>B214>鐵柱168>S9>P33=B184=莞研1號小冬瓜;不同冬瓜品種根際土壤中疫霉分離頻率、細菌、真菌和放線菌數(shù)量有一定差異，不同冬瓜品種的病情指數(shù)與可培養(yǎng)細菌數(shù)量、放線菌數(shù)量、B/F值（細菌數(shù)量/真菌數(shù)量）及A/F值（放線菌數(shù)量/真菌數(shù)量）均呈極顯著負相關，與疫霉分離頻率呈極顯著正相關。綜上所述，不同冬瓜品種根際土壤中的細菌和放線菌總量與品種抗性呈顯著正相關，而根際土壤中的疫霉菌數(shù)量和品種抗性呈顯著負相關。

關鍵詞：冬瓜;疫病;抗性;根際土壤;微生物

中圖分類號：S642.3 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）06-033-06

Correlation between phytophthora disease resistance of different wax gourd varieties and the numbers of microorganisms in rhizosphere soil

CHEN Kangli1， ZENG Lisha1， ZHOU Haiqi1， WANG Fang1， WU Yongguan 2， TANG Qilu1， WANG Yikui2， DU Caixian1， LI Yan 2

（1. Dongguan Banana and Vegetable Institute， Dongguan 523061， Guangdong， China; 2. Vegetable Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， Guangxi， China）

Abstract：In order to provided a basis for the evaluation of phytophthora disease resistance of different wax gourd varieties and the biological control mechanism of phytophthora disease， the differences of the number and functional diversity of rhizosphere microbial communities in the different resistant wax gourd varieties were studied.. In this experiment， different wax gourd varieties were used as materials. The natural disease nursery method was used to investigate the resistance of different wax gourd varieties to the phytophthora disease. Leaf disk induced counting method and plate dilution counting method were used to investigate the diversity of rhizosphere microorganisms of different wax gourd varieties. The results showed that the disease indices between the varieties of wax gourd were displayed as follows： Lübao > Xiaojiabiyu> B214> Tiezhu168> S9> P33=B184= Guanyan? No. 1 small wax gourd. There were significant differences in the isolation frequency of Phytophthora， the number of bacteria and fungi as well as actinomycetes in the rhizosphere soil of different wax gourd varieties. The disease indices of different wax gourd varieties was negatively correlated with the number of culturable bacteria， and actinomycetes， as well as B / F and A / F， but positively correlated with the isolation frequency of Phytophthora. In conclusion， the total amount of bacteria and actinomycetes in the rhizosphere soil are positively correlated with the variety resistance， while the total fungi are negatively correlated with the variety resistance.

Key words： Wax gourd; Phytophthora disease; Resistance; Rhizosphere soil; Microorganism

冬瓜疫病是由鞭毛菌亞門真菌疫霉菌（Phytophthora de Bary）侵染所致的一種土傳性病害，苗期和成株期均可侵害，主要危害瓜果、莖、葉等器官[1-3]。近年來，隨著冬瓜種植面積的擴大和復種指數(shù)的增大，加上冬瓜種植品種的單一化和種植地區(qū)的集中化，冬瓜疫病的發(fā)生日趨嚴重和頻繁，造成冬瓜大量減產，甚至絕收。生產上防治冬瓜疫病常見的方式是化學防治，對于防治冬瓜疫病藥劑的篩選和研究卓有成效，有安克可濕性粉劑、施得益可濕性粉劑、瑞毒鎂錳鋅可濕性粉劑等[4-5]。但化學防治方式有一定弊端，化學藥劑雖能殺死病菌，但同時也會大量殺死土壤中有益微生物，損害土壤的自我修復能力。此外，化學防治存在農藥殘留、環(huán)境污染、有害生物產生抗藥性等缺點。因此，選育抗病品種與相對安全無污染的生物生態(tài)防控技術成為近年來的研究重點。目前，生物防治研究工作主要集中在拮抗菌篩選與利用及作物自身抗病機制的研究方面[6]。左存武等[7]研究表明，高抗枯萎病香蕉海貢和抗枯5號等品種的根系分泌物具有殺真菌作用，對土壤微生物多樣性的研究為基礎的生物防治提供了一條思路。但這些拮抗菌及其衍生物常出現(xiàn)實驗室或盆栽栽培防治效果好，而大田生產防效則較差的現(xiàn)象，主要原因是田間土壤中微生物的復雜性、室外天氣等不可控因素多，以及不同抗性品種的根系分泌物存在差異等[8]。

目前對不同品種根際微生物的差異性研究已取得了一定的進展。漆艷香等[9]對22份抗、感枯萎病香蕉種質抽蕾期根際微生物數(shù)量研究表明，抽蕾期不同香蕉種質根際微生物數(shù)量存在顯著差異，抗病香蕉種質根際細菌、放線菌數(shù)量顯著高于感病種質，而根際真菌和Foc（尖孢鐮孢菌古巴?；停?shù)量顯著少于感病種質。王戈等[10]對不同烤煙品種不同生育時期以及接種黑脛病菌后根際可培養(yǎng)微生物數(shù)量差異進行了研究，結果表明，團棵期和旺長期細菌和放線菌數(shù)量與品種抗性呈正相關，真菌數(shù)量與品種抗性呈負相關。在人工接種黑脛病菌條件下，抗病品種根際環(huán)境刺激了細菌生長，而相對抑制感病品種細菌生長，不同品種均促進了根際真菌和放線菌生長，且真菌數(shù)量與品種抗性呈負相關。目前對不同抗、感疫病冬瓜品種與根際土壤微生物關系的研究尚未見報道。筆者通過研究不同冬瓜品種對疫病的抗病性及其與土壤微生物數(shù)量的關系，分析不同抗、感冬瓜品種的根系土壤中病原菌數(shù)量及微生物群落結構間的差異，以期為不同抗病性冬瓜品種的合理布局和冬瓜疫病的生物生態(tài)防治提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地設置在廣東省東莞市香蕉蔬菜研究所基地的大田。試驗地前茬種植冬瓜，為冬瓜疫病重病田，試驗地的土壤類型為壤砂土，供試土壤基本性狀為：pH 值 6.09，有機質含量（w，后同）為 1.2%，水解氮 122.7 mg·kg-1，銨態(tài)氮0 mg·kg-1， 硝態(tài)氮122.70 mg·kg-1，磷 70.90 mg·kg-1，鉀95.60 mg·kg-1。

1.2 材料

試驗品種從廣東、湖南及廣西等地收集引進，包括莞研1號、綠寶極早熟和鐵柱168等8個廣東省栽培面積較大的主推冬瓜品種。

1.3 方法

1.3.1 田間抗病性調查 為使試驗結果更加切合生產實際，采用田間自然感染發(fā)病。2017年4月份，對試驗冬瓜進行育苗，9月即冬瓜疫病發(fā)病高峰期對冬瓜疫病的發(fā)病情況進行調查，每個品種調查10株，3次重復。參照鄭果[11]的方法記錄冬瓜疫病的發(fā)病率，并對冬瓜的發(fā)病程度情況進行分級，計算不同品種的發(fā)病率及病情指數(shù)。

病情指數(shù)=Σ（各級病株數(shù)×各級代表值）/（調查總株數(shù)×最高嚴重度代表值）×100。

抗性分級標準：高抗（HR）：病情指數(shù)≤10;抗?。≧）：10<病情指數(shù)≤40;感病（S）：40<病情指數(shù)。

1.3.2 土壤中疫霉菌及微生物多樣性調查 種植冬瓜苗前，在試驗地里采用“S”形采樣法隨機取五點土樣，去掉0～5 cm的表土，取深約20 cm的土壤，剔除石礫、植物殘根等雜物，混合均勻，依四分法保留30～50 g土樣，無菌袋收集，置于0～4 ℃冷藏保存。

在調查不同冬瓜品種的發(fā)病情況時，隨機抽取5 株瓜苗，采集其根際土。小心鏟去冬瓜根表面5 cm的表土，收集附著在根系上的土壤作為根際土壤，并將相同冬瓜品種的土樣混合均勻，依四分法保留30～50 g土樣，用無菌袋收集，于0～4 ℃冷藏。

采用稀釋涂布平板法分離并計算土壤中的微生物數(shù)量。細菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂，放線菌用高氏1號瓊脂，真菌用馬丁氏瓊脂[12]。疫霉用選擇性V8汁培養(yǎng)基[13]，疫霉計數(shù)采用葉碟誘導計數(shù)法[14]（圖1）。將采集晾干的土樣研碎并過篩，取10 g研細的土樣裝入經滅菌的培養(yǎng)皿中，加滅菌水至飽和，在28 ℃培養(yǎng)箱中靜置24 h，用打孔器將冬瓜葉片切成直徑1 cm的圓形小塊若干塊，使其漂浮在土樣上面的無菌水中。每個處理設3個重復，置于28 ℃培養(yǎng)箱中，48 h后觀察葉片發(fā)病情況。受侵染的葉片邊緣出現(xiàn)水漬狀斑。將發(fā)病的葉片經70%酒精或0.1%升汞消毒，用無菌水洗凈后移入選擇性V8汁培培養(yǎng)基上，在28 ℃黑暗培養(yǎng)。待長出菌落，從邊緣挑取少量的菌絲鏡檢葉餌上的孢子囊，判斷是否是疫霉菌孢子囊，進而計算疫霉分離頻率。

疫霉分離頻率/%=Σ著生孢子囊葉餌數(shù)/檢查葉餌總數(shù)×100。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同冬瓜品種的田間抗病性與根際土壤疫霉菌

由表1可知，8份冬瓜品種的田間自然發(fā)病率、病情指數(shù)以及疫霉分離頻率等指標存在一定差異。冬瓜田間自然發(fā)病率及病情指數(shù)從高到低分別是：綠寶極早熟>小家碧玉>B214>鐵柱168>S9>P33=B184=莞研1號小冬瓜，其中P33、莞研1號小冬瓜、B184在冬瓜病地種植90 d后均沒有發(fā)病，表明P33、莞研1號小冬瓜、B184這3份冬瓜品種田間表現(xiàn)為高抗;B214、鐵柱168及S9的田間自然發(fā)病率為10%～20%，病情指數(shù)為10～40，表明B214、鐵柱168及S9這3份冬瓜品種田間表現(xiàn)為抗病;綠寶極早熟和小家碧玉田間自然發(fā)病率達30%以上，病情指數(shù)達到40以上，表明綠寶極早熟和小家碧玉這2份冬瓜品種田間表現(xiàn)為感病。

不同冬瓜品種根際土壤中的疫霉菌采用葉碟誘導法進行誘導分離后，在選擇性V8汁培養(yǎng)基中受侵染的葉片邊緣出現(xiàn)水漬狀斑，隨后長出稀疏的菌絲并形成白色菌落（圖2）。根際土壤中疫霉菌數(shù)量多的是綠寶極早熟、小家碧玉及B214冬瓜，疫霉分離頻率高達100%，表明以上3份冬瓜品種對疫霉的富集能力強，比較容易被疫霉病菌侵染，進而可能導致這些品種的田間自然發(fā)病率高。S9、鐵柱168和P33等 3份冬瓜品種的根際土壤中疫霉菌的數(shù)量較多，疫霉分離頻率在50%以上;其根際土壤中疫霉菌數(shù)量較少的品種是莞研1號小冬瓜和B184，疫霉分離頻率在50%以下，可推測這兩份冬瓜品種感染疫病的概率相對較小。

2.2 不同冬瓜品種根際土壤微生物多樣性

由圖3可以看出，冬瓜根際土壤微生物均以細菌最多，其次是放線菌，真菌最少。其中，B214、P33、B184和莞研1號小冬瓜4個品種冬瓜土壤中細菌數(shù)量均比種植前多，其他4個品種根際土壤中細菌數(shù)均低于種植前;根際細菌數(shù)量較多的是P33、B184，根際細菌數(shù)量最少的是小家碧玉，P33、B184根際細菌數(shù)顯著高于小家碧玉，但與其他5個品種差異不顯著。真菌數(shù)量最多的是B214，真菌數(shù)量較少的是S9、B184和莞研1號小冬瓜;與種植前相比，種植冬瓜后土壤中真菌數(shù)量均有所降低，抗病品種S9、B184和莞研1號小冬瓜根系的真菌顯著低于種植前的土壤真菌數(shù)量。種植冬瓜后土壤中放線菌數(shù)量最多的是B184，其次是P33和莞研1號小冬瓜;與種植前相比，土壤中放線菌數(shù)量顯著減少的冬瓜品種有小家碧玉、綠寶極早熟和鐵柱168。

抗病品種莞研1號小冬瓜和B184的B/F值 （細菌數(shù)量/真菌數(shù)量）和A/F值（放線菌數(shù)量/真菌數(shù)量）均較大，小家碧玉和B214的B/F值均較低，綠寶極早熟和小家碧玉的A/F值均較低。其中，莞研1號小冬瓜和B184的B/F值均顯著高于小家碧玉和B214，且均與其他4個品種差異不顯著;莞研1號和B184的A/F值均顯著高于綠寶極早熟、小家碧玉、B214和鐵柱168;且均與其他2個品種差異不顯著。表明種植這2個冬瓜品種后的土壤微生物區(qū)系為高肥的“細菌主導型”土壤，相對于其他栽培品種更健康。

由表2可以看出，不同抗、感疫病冬瓜品種的病情指數(shù)與可培養(yǎng)細菌數(shù)量、放線菌數(shù)量、B/F值及A/F值均呈極顯著負相關，與疫霉分離頻率呈極顯著正相關，表明冬瓜根際細菌數(shù)量、放線菌數(shù)量、B/F值及A/F值與品種抗性呈極顯著正相關，而病原疫霉菌數(shù)量則與品種抗性呈極顯著負相關。

3 討論與結論

植物在生長過程中，根系會通過各種方式向周圍環(huán)境釋放多種無機、有機物質——根系分泌物。根分泌物為根際土壤中的微生物提供了能源物質，其成分和數(shù)量會影響根際微生物的種群結構和數(shù)量[15-16]。影響根系分泌物的因素有很多，其中植物品種和作物基因型不同，其產生的根系分泌物的組成及數(shù)量也不同[17-20]。作物根際微生物的數(shù)量和群落結構變化與作物土傳病害的發(fā)生關系密切，一定程度上也是作物根際土壤微生物群體互作的結果[21]。

相關研究表明，土壤中細菌數(shù)量的增加有利于土壤養(yǎng)分的轉化，能為植物的生長提供良好的環(huán)境，并且為有機、無機物的轉化提供理想的條件;而土壤中放線菌數(shù)量的增加不僅能促進土壤有機質轉化，還能產生抗生素，對其他有害微生物起到一定的拮抗作用[22-26]。筆者的研究結果表明，種植P33、B184和莞研1號小冬瓜等抗病品種后，土壤中的細菌數(shù)量及放線菌數(shù)量增加，而真菌數(shù)量降低。這可能與抗病冬瓜品種所分泌的根系分泌物能抑制病原真菌的繁殖與生長，促進細菌和放線菌繁殖與生長有關。此外，種植抗病冬瓜品種后，細菌和放線菌數(shù)量的增加成為冬瓜根際土壤的優(yōu)勢菌群，一定程度上能有效地降低了根際真菌數(shù)量，且與病原微生物競爭養(yǎng)分，間接抑制有害微生物的生長，使根際微生物區(qū)系向健康的方向發(fā)展。

綜合分析表明，冬瓜根際細菌數(shù)量、放線菌數(shù)量、B/F值及A/F值與品種抗性呈極顯著正相關，而病原疫霉菌數(shù)量則與品種抗性呈極顯著負相關，此結果與漆艷香等[9]、王戈等[10]的研究結論相似。此外，韓李菲[27]研究表明，海貢、抗枯5號等抗枯萎病的香蕉品種，其根系分泌物中有抗真菌成分，有的品種有殺菌作用，可應用于植物源殺菌劑，有的品種能夠抑制菌絲的生長和孢子萌發(fā)，但無殺菌作用。巴西蕉等感病香蕉的根系分泌物能為病原物的生長提供營養(yǎng)。上述研究表明抗病冬瓜品種的根系分泌物可能促進細菌與放線菌的繁殖與生長，抑制真菌病原菌的繁殖與生長;而感病冬瓜品種的根系分泌物可能抑制細菌與放線菌的繁殖與生長，促進真菌病原菌的繁殖與生長。

筆者在本試驗中初步探索了冬瓜疫病田間自然發(fā)病與根際微生物之間的聯(lián)系與差異，可為研究冬瓜疫病生物生態(tài)防治機制提供依據(jù)。但只是基于傳統(tǒng)平板稀釋計數(shù)法對部分冬瓜品種的根際微生物進行初步研究，接下來還需擴大品種樣本量進一步研究抗、感病冬瓜種質根際微生物差異并弄清其差異形成的機制，探究抗、感疫病冬瓜種質內生微生物的差異及多樣性;并對抗、感疫病冬瓜種質所分泌的根系分泌物組成和數(shù)量的差異及其對土壤微生物的影響作進一步的研究。

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