維拉帕米對替芬泰大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)的作用

張愛杰，楊帆龍，趙 鹿，李 偲，董世奇，劉鑒峰，樊慧蓉

(1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所、2. 創(chuàng)新藥物放射性藥代研究重點實驗室，天津 300192；3. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617)

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B virus，CHB)是一種由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)持續(xù)感染引起的肝臟慢性炎癥性疾病。目前還沒有治療CHB的特效藥，臨床上多是聯(lián)合使用核苷類藥物(nucleoside analogues，NAs)、干擾素和保肝降酶藥物，力求最大限度地長期抑制HBV復(fù)制[1-4]。雖然NAs藥物臨床應(yīng)用廣泛，但耐藥性的發(fā)生率也較高[5]。耐藥性已成為CHB治療的挑戰(zhàn)，急需開發(fā)新的具有抗耐藥HBV的藥物。

替芬泰(Y101)是一種抗HBV候選新藥，根據(jù)苗藥馬蹄金(dichondrarepensForst.)的活性成分馬蹄金素設(shè)計的苯丙酸二肽衍生物[6]。替芬泰能抑制共價閉合環(huán)狀DNA的轉(zhuǎn)換，從而抑制HBV復(fù)制，阻斷病毒的持續(xù)存在，停藥后無明顯反跳，且對NAs耐藥株具有較強的抑制效果[6-8]。在劑量遞增臨床試驗中，替芬泰在一定劑量范圍內(nèi)安全性和耐受性良好[9]。

本研究組前期報道替芬泰在大鼠體內(nèi)代謝廣泛[10]，M8是替芬泰的酰胺水解產(chǎn)物，為替芬泰的主要代謝物，M9為M8的氮氧化代謝物；另外，通過Caco-2和MDCK-MDR1細胞模型的轉(zhuǎn)運研究，證明替芬泰是轉(zhuǎn)運體P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的底物[11]。然而替芬泰與其他P-gp底物或抑制劑藥物合用是否改變其體內(nèi)藥動學(xué)特征尚未見報道。因此，本研究目的是：(1)建立測定大鼠血漿中替芬泰、M8和M9濃度的LC-MS/MS方法，并進行方法學(xué)驗證；(2)研究臨床常用藥物維拉帕米(P-gp抑制劑)對替芬泰在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的作用，為替芬泰進一步研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑Y101原料藥(批號20191106，純度99.5%)、M8(批號20191128，純度99.0%)和M9(批號20191128，純度99.0%)均來源于貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室；鹽酸維拉帕米(批號20181128，純度98.0%)購自南京羅邁美生物科技有限公司；烏苯美司(批號190603，純度98.0%)由深圳萬樂藥業(yè)有限公司提供；甲醇，乙腈等均為色譜純，由Thermo Fisher公司提供；去離子水使用屈臣氏水。

1.2 實驗儀器采用配有LC-30AD二元泵、CTO-30A柱溫箱和SIL-30AC自動進樣器的液相色譜系統(tǒng)(日本Shimadu公司)；質(zhì)譜檢測器采用Sciex TRIPLE QUADTM 5500三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜(美國Applied Biosystems公司)并配備電噴霧離子源(ESI)和Analyst1.7.1數(shù)據(jù)處理軟件；Sartorius SQP型分析天平(德國Sartorius公司)；Legend Micro 17R臺式離心機(美國Thermo Scientific公司)；Auto Vap S60型樣品全自動濃縮儀(美國ART公司)；XYN-60LMGE型氮氣發(fā)生器(上海析友分析儀器有限公司)；TARGIN VX-Ⅱ型多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司)。

1.3 實驗動物健康雄性SD大鼠(SPF級，合格證編號：1100111911032465)，體質(zhì)量(200-220) g，購自北京維通利華試驗動物有限公司。實驗動物使用許可證編號：SYXK(津)2018-0008。在SPF動物房對大鼠實施頸靜脈插管手術(shù)，術(shù)后飼養(yǎng)恢復(fù)3 d，期間狀態(tài)良好的大鼠用于藥代動力學(xué)實驗。實驗前12 h禁食不禁水。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件色譜條件：液相色譜系統(tǒng)采用日本Shimadu公司的30A型液相，色譜柱為Infinitylab Poroshell 120 EC-C18(50 mm×2.1 mm, 2.7 μm, 美國Agilent 公司)，柱溫40 ℃，進樣體積1 μL，流速0.3 mL·min-1，流動相A：0.05%甲酸-乙腈，流動相B：0.05%甲酸-1 mmol·L-1乙酸銨-5%乙腈水溶液，梯度洗脫程序為：0-0.2 min (85% B) →2-4 min (15% B) →4.1-5.5 min (85% B)，儀器運行時間為5.5 min。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜采用美國Applied Biosystems公司的Sciex TRIPLE QUADTM 5500型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測；卷簾氣：20 psi；噴霧電壓：4 000 V；源溫度：550 ℃；去簇電壓：100 V；入口電壓：10 V。替芬泰、M8、M9和內(nèi)標(biāo)烏苯美司用于定量分析的離子對和碰撞能分別為m/z490.2→339.4 (Y101)，碰撞能：18 V；m/z357.2→105.0 (M8)，碰撞能：37 V；m/z373.2→105.0 (M9)，碰撞能：35 V；m/z309.2→120.1 (IS：烏苯美司)，碰撞能：30 V。Y101、M8、M9和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜圖見Fig 1。

Fig 1 Product ion mass spectra of [M+H]+ of Y101 (A),(B) , M9 (C) and bestatin (D, internal standard)

1.5 對照品溶液配制分別精確稱取Y101、M8、M9對照品適量，溶解并定容配制成濃度為800 mg·L-1的Y101甲醇溶液、1 000 mg·L-1的M8、M9的60%甲醇水溶液作為儲備液。準(zhǔn)確量取儲備液，用甲醇逐級稀釋成系列濃度工作液，Y101系列標(biāo)準(zhǔn)工作液為5、10、50、200、500、2 000、2 500 μg·L-1，質(zhì)控工作液濃度為12.5、250、1 875 μg·L-1；M8系列標(biāo)準(zhǔn)工作液為5、10、50、200、1 000、4 000、5 000 μg·L-1，質(zhì)控工作液濃度為12.5、250、3 750 μg·L-1；M9系列標(biāo)準(zhǔn)工作液為1、2、10、40、200、800、1 000 μg·L-1，質(zhì)控工作液濃度為2.5、50、750 μg·L-1。

精確稱取烏苯美司(內(nèi)標(biāo))對照品，用甲醇配制成800 mg·L-1的儲備液，并用甲醇逐級依次稀釋成1 mg·L-1的內(nèi)標(biāo)工作液，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 樣品處理方法依次向50 μL大鼠含藥血漿加入150 μL甲醇和50 μL內(nèi)標(biāo)工作液(烏苯美司，1 mg·L-1)，渦旋1 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min；取上清液50 μL，加入含200 μL的50%甲醇-水的離心管中，渦旋1 min，取樣100 μL于內(nèi)插管中，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min，進樣1 μL進行LC-MS/MS定量分析。

1.7 方法學(xué)驗證本方法選用LC-MS/MS法定量測定大鼠血漿樣品中替芬泰、M8和M9的濃度，并從專屬性、線性范圍、靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、回收率、穩(wěn)定性方面對其進行方法學(xué)驗證，驗證過程中的所有操作方法均按照生物樣品測定的相關(guān)要求開展[12]。

1.8 大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究8只SD雄性大鼠分成兩組，每組4只，對照組灌胃給予60 mg·kg-1的替芬泰，實驗組先后灌胃給予25 mg·kg-1的維拉帕米和60 mg·kg-1的替芬泰、維拉帕米和替芬泰均用1%的羧甲基纖維素鈉配制成混懸液。分別在給藥前(0 h)和給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、9、12、24、30、48 h經(jīng)頸靜脈插管采血0.25 mL于肝素化EP管中，同時補充同體積的生理鹽水。全血立即在4 ℃、1 2000 r·min-1離心5 min，分離血漿，存于-80 ℃冰箱待測。

1.9 數(shù)據(jù)處理應(yīng)用Analyst 1.7.1軟件對待測物替芬泰、M8、M9和內(nèi)標(biāo)烏苯美司進行積分，得出峰面積。待測物濃度作為橫坐標(biāo)，待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值作為縱坐標(biāo)，使用加權(quán)最小二乘法(權(quán)重為1/x2)進行回歸運算，求得的直線回歸方程即為校正曲線。根據(jù)計算機軟件默認的四舍五入規(guī)則，對于>1 000的數(shù)據(jù)保留至整數(shù)位數(shù)字，對0.1-1 000的測定與計算數(shù)據(jù)保留3位有效數(shù)字，<0.1的數(shù)值保留3位小數(shù)。使用WinNonlin 8.1軟件對血藥濃度數(shù)據(jù)進行處理并計算藥代動力學(xué)參數(shù)，采用非房室模型統(tǒng)計矩法計算藥代參數(shù)Cmax、Tmax、AUC0-t、AUC0-∞、T1/2、CL。參數(shù)經(jīng)SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，定量資料采用t檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗證

2.1.1專屬性 待測物和內(nèi)標(biāo)烏苯美司的典型MRM色譜圖見Fig 2，從圖可知該方法對待測物替芬泰、M8、M9和內(nèi)標(biāo)的專屬性好，大鼠血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物的測定，滿足定量要求。

2.1.3靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度 結(jié)果見Tab 1，待測物替芬泰、M8、M9的日內(nèi)和日間的精密度和準(zhǔn)確度均滿足生物樣品測定的相關(guān)要求[12]。

Tab 1 Precision and accuracy of Y101 and its metabolites M8,M9 in rat plasma by LC-MS/MS

2.1.4基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率 待測物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率均滿足定量要求，生物樣品的基質(zhì)效應(yīng)不影響待測物的濃度測定。

2.1.5穩(wěn)定性 替芬泰、M8和M9在室溫放置4 h、-80 ℃室溫循環(huán)凍融3次、-80 ℃長期凍存25 d、樣品處理后自動進樣器放置72 h的準(zhǔn)確度均在85%-115%之間，RSD<15%，說明血漿樣品中待測物在分析過程中穩(wěn)定性良好。

2.2 維拉帕米對替芬泰大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的作用

2.2.1P-gp抑制劑維拉帕米對替芬泰藥動學(xué)的影響 大鼠單次灌胃給藥后替芬泰的血漿藥物濃度-時間曲線見Fig 3A，藥動學(xué)參數(shù)見Tab 2。結(jié)果表明，灌胃給藥后替芬泰吸收迅速(0.938±1.38) h達峰，達峰后血藥濃度迅速下降，半衰期T1/2為(1.38±0.148) h。而維拉帕米作為轉(zhuǎn)運體P-gp抑制劑，與替芬泰聯(lián)合用藥后替芬泰的AUC0-t顯著升高(P<0.05)，AUC0-t達到單獨給藥組的1.71倍(P<0.05)，CL也降為單獨給藥組的61%，提示維拉帕米通過抑制P-gp而提高了替芬泰在腸道的吸收。

2.2.2P-gp抑制劑維拉帕米對M8藥動學(xué)的影響 大鼠單次灌胃給藥后M8的血漿藥物濃度-時間曲線見Fig 3B，藥動學(xué)參數(shù)見Tab 2。結(jié)果表明，M8體內(nèi)達峰較晚，Cmax和AUC0-t顯著高于替芬泰，且AUC0-t為原型藥物替芬泰的5倍，提示M8是替芬泰灌胃給藥后血漿中主要的代謝產(chǎn)物。合用P-gp抑制劑維拉帕米對M8的血漿濃度影響較小，其藥動學(xué)參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

Tab 2 The pharmacokinetic parameters of Y101 and its metabolites (M8/M9) after single intragastric administration of Y101 (60 mg·kg-1) and Y101+verapamil (25 mg·kg-1) in rats n=4)

2.2.3P-gp抑制劑維拉帕米對M9藥動學(xué)特征的影響 大鼠單次灌胃給藥后M9的血漿藥物濃度-時間曲線見Fig 3C，藥動學(xué)參數(shù)見Tab 2。結(jié)果表明，M9體內(nèi)達峰較晚，Cmax和AUC0-t明顯低于替芬泰和M8，且AUC0-t為原型藥物替芬泰的1/5倍。合用P-gp抑制劑維拉帕米對M9的藥動學(xué)特征有一定影響，兩藥合用組AUC0-t值是單獨給藥組的1.58倍(P<0.05)，CL降為單獨給藥組的62%。

Fig 2 Typical MRM chromatograms of Y101, M8, M9 and bestatin (internal standard) in rat plasma

Fig 3 Mean plasma concentration-time profile of Y101 and its metabolites (M8/M9) after single intragastric administration of Y101 (60 mg·kg-1) and Y101+verapamil (25 mg·kg-1) in n=4)

3 討論

替芬泰作為一個抗HBV候選新藥，有著很大的臨床應(yīng)用潛力。然而對于替芬泰的系統(tǒng)深入研究仍然不足，例如目前還沒有同時測定大鼠血漿中替芬泰及其代謝產(chǎn)物的LC-MS/MS方法學(xué)相關(guān)報道，而且有關(guān)替芬泰體內(nèi)藥物相互作用研究較為欠缺。有研究者建立了測定大鼠血漿中替芬泰濃度的LC-MS/MS方法，該方法沒有同時檢測血漿中主要代謝物M8和M9[13]。因此，本研究建立一個快速、靈敏、可靠的LC-MS/MS定量方法，可以同時測定大鼠血漿中替芬泰、M8和M9的濃度，并將該方法應(yīng)用于維拉帕米對替芬泰大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的作用研究，為替芬泰的深入研究提供方法上的支持和實驗依據(jù)。

替芬泰是轉(zhuǎn)運體P-gp的底物，但在體內(nèi)合用其它P-gp抑制劑或底物藥物是否改變替芬泰的藥動學(xué)特征未見報道。因此，我們設(shè)計大鼠體內(nèi)單次灌胃給藥的藥動學(xué)實驗，考察替芬泰合用P-gp抑制劑維拉帕米后，大鼠體內(nèi)替芬泰及其代謝物的藥動學(xué)變化，分析P-gp抑制劑維拉帕米對替芬泰吸收影響的可能機制。實驗結(jié)果表明，與單獨給藥組比較，合用維拉帕米可以明顯提高替芬泰的AUC0-t值(Tab 2，P<0.05)，提示可能與維拉帕米競爭性抑制腸道P-gp[14]減少替芬泰外排有關(guān)；同時清除率明顯降低(Tab 2，P<0.05)，T1/2無明顯改變，提示清除率改變與替芬泰暴露量增加有關(guān)，而替芬泰體內(nèi)消除沒有明顯改變。文獻報道維拉帕米還可以抑制有機陽離子轉(zhuǎn)運體1、多藥耐藥蛋白3和多藥耐藥相關(guān)蛋白1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運[15-17]，這些轉(zhuǎn)運體是否與替芬泰暴露量改變相關(guān)需要進一步深入研究。

維拉帕米對代謝物M9作用結(jié)果顯示，AUC0-t和清除率的變化趨勢與替芬泰一致，提示替芬泰暴露量增加可能也相應(yīng)提高了代謝轉(zhuǎn)化為M9的比例。然而與M9相比，M8的AUC0-t、清除率等藥動學(xué)參數(shù)沒有變化，提示P-gp抑制劑維拉帕米雖增加替芬泰體內(nèi)暴露，但并不相應(yīng)提高M8的代謝轉(zhuǎn)化，因此推測維拉帕米可能抑制替芬泰轉(zhuǎn)化為M8的代謝酶。M8為替芬泰的酰胺水解產(chǎn)物，該過程可能是水解酶介導(dǎo)的[17]。以此為切入點，我們前期考察了氨肽酶抑制劑烏苯美司和腎脫氫肽酶抑制劑西司他丁對替芬泰和M8轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果提示氨肽酶和腎脫氫肽酶與替芬泰生物轉(zhuǎn)化無關(guān)。目前，本課題組正在開展替芬泰代謝轉(zhuǎn)化為M8的代謝酶研究。因此，臨床上替芬泰聯(lián)合使用轉(zhuǎn)運體P-gp底物或抑制劑藥物時，注意是否造成異常的藥物濃度升高，需要根據(jù)具體情況調(diào)整替芬泰的給藥劑量。

綜上，本研究建立了一種快速、靈敏、可靠的LC-MS/MS定量方法，并進行了方法學(xué)驗證，用以測定大鼠血漿中替芬泰、M8和M9的濃度。我們應(yīng)用建立的LC-MS/MS方法研究轉(zhuǎn)運體P-gp介導(dǎo)的替芬泰和其他藥物發(fā)生的藥物相互作用，首次闡明替芬泰和P-gp抑制劑維拉帕米合用對替芬泰在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的影響，為后期深入研究基于轉(zhuǎn)運體的藥動學(xué)相互作用和藥物開發(fā)提供了參考依據(jù)。