eNOS/PKG-1通路在L-精氨酸抗野百合堿所致大鼠右心室重構(gòu)中的作用

任星橋，李曉彤，林小英，曾凡群，李葉麗，楊丹莉

(遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

右心室重構(gòu)導(dǎo)致的心力衰竭是肺動(dòng)脈高壓患者死亡的主要原因之一[1]。目前認(rèn)為右心室重構(gòu)主要涉及心肌細(xì)胞肥大、凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激及一氧化氮(nitric oxide，NO)缺乏等方面[2]。其中，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)催化L-精氨酸(L-Arginine，L-arg)生成NO，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制劑NG-硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)可阻斷上述反應(yīng)。L-NAME是NOS的抑制劑，能夠降低細(xì)胞內(nèi)NO含量，誘導(dǎo)大鼠左心室肥厚[3]。eNOS的表達(dá)降低可引起NO生成減少，下游蛋白激酶G1(protein kinase G1，PKG-1)表達(dá)降低，使細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高，導(dǎo)致血管收縮，心肌細(xì)胞肥大，促進(jìn)心室重構(gòu)的發(fā)生。PKG又稱環(huán)磷酸鳥苷依賴型蛋白激酶，有PKG-1和PKG-2兩種類型[4]，其中PKG-1主要分布于血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，PKG-1可使肌球蛋白輕鏈去磷酸化，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度降低，產(chǎn)生舒張血管、抑制心肌細(xì)胞肥大等作用。野百合堿(monocrotaline，MCT)所致大鼠右心室重構(gòu)模型，是目前常用于研究右心室重構(gòu)的病理模型[5]。目前PKG-1在L-arg改善MCT所致右心室重構(gòu)中的作用鮮有報(bào)道。本研究旨在借助工具藥L-NAME，探討eNOS/PKG-1通路在L-arg干預(yù)MCT所致大鼠右心室重構(gòu)的作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

1.1.1藥品 MCT(產(chǎn)品編號：C2401-1G，Sigma公司)；L-精氨酸(產(chǎn)品編號：HY-N0455，MCT公司)；L-NAME(產(chǎn)品編號：HY-18729A，MCT公司)。

1.1.2試劑 cTnI兔單克隆抗體(產(chǎn)品編號：ab209809，abcam公司)；eNOS小鼠單克隆抗體(產(chǎn)品編號：ab76198，abcam公司)；PKG-1兔單克隆抗體(產(chǎn)品編號：#3248，Cell Signaling公司)；GAPDH兔多克隆抗體(產(chǎn)品編號：10494-1-AP，Proteintech公司)；β-actin兔多克隆抗體(產(chǎn)品編號：AF7018，Affinity公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(產(chǎn)品編號：S0001，Affinity公司)；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(產(chǎn)品編號：SA00001-1，Proteintech公司)。

1.2 儀器PowerLab/8SP生物監(jiān)測儀(澳大利亞AD instruments公司)；BX43+DP2b正置顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)；5417R離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；Supply Mini-Protean 3電泳儀(美國BIO-RAD公司)；Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；ChemiDoc成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組體質(zhì)量(180-220) g，♂SD(Sprague Dawley，SD)大鼠20只，無特定病原體(specific pathogen-free animal)SPF級，購買于長沙天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(湘)2014-0011。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件：室溫19℃-25℃，相對濕度40%-70%，將所有SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(Control組)、模型組(MCT組)、L-精氨酸組(L-arg組，200 mg·kg-1)和L-精氨酸+L-NAME組(L-arg+L-NAME組，200、20 mg·kg-1)。除Control組，其余各組大鼠均采用頸背部一次性皮下注射MCT(55 mg·kg-1)，建立右心室重構(gòu)模型，Control組大鼠頸背部一次性皮下注射等體積生理鹽水作對照。造模14 d后開始給藥，L-arg組和L-arg+L-NAME組大鼠每日腹腔注射L-arg，其中L-arg+L-NAME組大鼠每日灌胃L-NAME，Control組和MCT組大鼠每日灌胃等體積雙蒸水，持續(xù)14 d。

1.4 血流動(dòng)力學(xué)檢測給藥14 d后，采用右心導(dǎo)管術(shù)檢測大鼠右心室壓。大鼠稱質(zhì)量，剪開頸部右側(cè)皮膚，鈍性分離皮下組織和肌肉，游離頸外右靜脈。將連接壓力傳感器的導(dǎo)管慢慢推入右側(cè)頸外靜脈，經(jīng)右心房插入右心室，記錄右心室壓力波形變化。

1.5 大鼠右心室質(zhì)量指數(shù)的測定血流動(dòng)力學(xué)檢測后摘取心臟，迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中清洗，于冰上分離右心室游離壁，濾紙蘸干水分，稱質(zhì)量記錄，計(jì)算右心室質(zhì)量指數(shù)=右心室質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.6 右心室形態(tài)學(xué)觀察取大鼠右心室組織置于4%甲醛溶液中，固定48 h。脫水、石蠟包埋、制備組織切片，厚度約為3 μm，進(jìn)行HE染色，中性樹脂封片。自然晾干后，于Olympus正置顯微鏡下觀察右心室病理學(xué)變化并拍照。

1.7 Western blot檢測大鼠右心室cTnI、eNOS和PKG-1蛋白的表達(dá)稱取大鼠右心室組織約50 mg剪碎，加入0.5 mL裂解液(RIPA裂解液 ∶PMSF溶液 ∶蛋白磷酸酶抑制劑=100 ∶1 ∶1)，使用眼科剪置于冰上剪碎，冰上靜置裂解30 min后配平離心，條件：4 ℃、12 000 r·min-1、15 min，吸取上清液于-80 ℃冰箱保存。BCA法測定上清液的蛋白含量，配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠(上層5%濃縮膠，下層12%或8%分離膠)，蛋白樣品經(jīng)電泳分離后，使用半干轉(zhuǎn)印槽轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，7%脫脂牛奶搖床室溫封閉約3 h，TBST洗去牛奶(每次10 min，共3次)，4 ℃過夜孵育一抗(>16 h)：cTnI(1 ∶2 500)、eNOS(1 ∶1 000)、PKG-1(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶10 000)、β-actin(1 ∶5 000)，TBST洗膜，室溫孵育二抗(1 ∶5 000)約40 min、TBST洗膜后使用化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)，于成像系統(tǒng)獲取圖像進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 L-arg對大鼠右心室最大壓的影響給藥14 d后，與Control組相比，MCT組大鼠右心室最大壓明顯升高(P<0.05)是Control組的1.74倍；與MCT組相比，L-arg組大鼠右心室最大壓降低35.95%(P<0.05)；與L-arg組相比，L-arg+L-NAME組大鼠右心室最大壓明顯升高(P<0.05)，是L-arg組1.51倍。

Fig 1 Effect of L-arg on right ventricular max pressure in rats n=5)

2.2 L-arg對大鼠一般狀況、體質(zhì)量、右心室質(zhì)量指數(shù)的影響給藥14 d后觀察，Control組大鼠毛色光澤、呼吸平穩(wěn)、體質(zhì)量逐漸增加；MCT組大鼠毛色發(fā)暗、呼吸急促、活動(dòng)和進(jìn)食減少、體質(zhì)量逐漸減輕；L-arg組大鼠毛色較為光滑、呼吸較為平穩(wěn)；L-arg+L-NAME組大鼠一般狀況與MCT組大鼠一致。與Control組相比，MCT組大鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.05)，右心室質(zhì)量指數(shù)明顯升高(P<0.05)；與MCT組相比，L-arg組大鼠體質(zhì)量明顯增加(P<0.05)，右心室質(zhì)量指數(shù)明顯下降(P<0.05)；L-arg+L-NAME組大鼠相較于L-arg組右心室質(zhì)量指數(shù)明顯升高(P<0.05)，體質(zhì)量明顯下降(P<0.05)。

2.3 L-arg對大鼠右心室病理學(xué)的影響HE染色發(fā)現(xiàn)，Control組大鼠右心室無明顯病理學(xué)損傷，其心肌細(xì)胞排列有序，細(xì)胞形態(tài)正常；MCT組大鼠右心室心肌細(xì)胞明顯肥大且排列紊亂，伴隨炎性細(xì)胞浸潤；L-arg組大鼠右心室心肌細(xì)胞排列較為整齊，心肌細(xì)胞肥大有所改善；L-arg+L-NAME組大鼠右心室心肌細(xì)胞肥大，且排列紊亂，細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)腫脹，伴有炎性細(xì)胞浸潤。

Tab 1 Effect of L-arg on body weight and right ventricular mass index in rats n=5)

Fig 2 Effect of L-arg on right ventricular morphology in ratsA：Control；B：MCT；C：L-arg；D：L-arg+L-NAME

2.4 L-arg對大鼠右心室cTnI蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，MCT組大鼠右心室cTnI蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，是Control組的1.15倍(P<0.05)。與MCT組相比，L-arg組大鼠右心室cTnI蛋白表達(dá)下調(diào)36.16%(P<0.05)，L-arg+L-NAME組大鼠右心室cTnI蛋白的表達(dá)與L-arg組相比上調(diào)36.44%(P<0.05)。

Fig 3 Effect of L-arg on the protein expression of cTnI in right ventricle of rats n=3)

2.5 L-arg對大鼠右心室eNOS和PKG-1蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，MCT組大鼠右心室eNOS和PKG-1蛋白表達(dá)分別下調(diào)41.83%、45.16%(P<0.05)。與MCT組相比，L-arg組大鼠右心室eNOS和PKG-1蛋白表達(dá)分別上調(diào)73.42%、56.56%(P<0.05)，L-arg+L-NAME組大鼠右心室eNOS和PKG-1蛋白的表達(dá)與L-arg組相比分別下調(diào)38.25%、40.97%(P<0.05)。

Fig 4 Effect of L-arg on the protein expression of eNOS and PKG-1 in right ventricle of rats n=3)

3 討論

L-arg是一種人工合成的強(qiáng)效血管擴(kuò)張劑，也是體內(nèi)NO的供體，上調(diào)L-arg水平時(shí)，NO的生成增多[6]。研究表明，L-arg干預(yù)可改善冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法誘導(dǎo)的大鼠急性心肌梗死[7]。MCT是一種吡咯烷生物堿，在肝臟內(nèi)經(jīng)P450單氧化酶轉(zhuǎn)化為野百合堿吡咯[8]，破壞肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起肺血管不可逆性損傷，導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓力升高，繼發(fā)右心室重構(gòu)，嚴(yán)重可發(fā)展為右心衰竭甚至死亡。目前常用皮下注射或腹腔注射MCT的方法[9]，制備研究肺動(dòng)脈高壓和右心室重構(gòu)的病理模型。本研究借用工具藥L-NAME，探討eNOS/PKG-1通路在L-arg干預(yù)右心室重構(gòu)中作用。

本研究結(jié)果顯示，與Control組相比，MCT組大鼠體質(zhì)量明顯減輕；右心室最大壓和右心室質(zhì)量指數(shù)明顯升高；心肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大，且排列紊亂，伴有炎性細(xì)胞浸潤，說明MCT組大鼠出現(xiàn)右心室重構(gòu)，造模成功，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[10-11]。與MCT組相比，L-arg組大鼠體重明顯增加；右心室最大壓和右心室質(zhì)量指數(shù)均明顯降低；心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂、炎性浸潤均明顯減輕，說明L-arg可改善MCT所致大鼠右心室重構(gòu)。與L-arg組相比，L-arg+L-NAME組大鼠在右心室最大壓、右心室質(zhì)量指數(shù)、病理結(jié)果各方面變化趨勢與MCT組相較一致，提示L-NAME作為NOS的抑制劑，可以逆轉(zhuǎn)L-arg抗MCT所致右心室重構(gòu)的作用。

心肌肌鈣蛋白(cardiac troponin，cTn)是一種心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，由cTnT、cTnC和cTnI 3個(gè)亞基組成。正常情況下，胞質(zhì)內(nèi)游離的cTnI較少，當(dāng)心肌細(xì)胞受損時(shí)，結(jié)合于心肌結(jié)構(gòu)蛋白中的cTnI等亞基逐漸分解并通過受損的心肌細(xì)胞膜入血。因此，cTnI是公認(rèn)的特異性心肌損傷標(biāo)志物。臨床通過檢測血清中cTnI的含量以判斷心肌損傷[12]。有文獻(xiàn)報(bào)道，五味子醇甲通過下調(diào)心肌細(xì)胞cTnI蛋白的表達(dá)可改善去甲腎上腺素誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥大[13]。本研究結(jié)果顯示，與Control組相比，MCT組右心室組織cTnI蛋白表達(dá)上調(diào)；L-arg能抑制MCT所致的右心室組織cTnI蛋白表達(dá)的上調(diào)；而L-NAME作為eNOS的抑制劑能抑制L-arg的上述作用。結(jié)合L-arg可以抑制MCT引起的右心室肥大等結(jié)果，提示L-arg可能通過抑制cTnI亞基從心肌結(jié)構(gòu)蛋白中解離從而抑制右心室重構(gòu)。

在心肌細(xì)胞內(nèi)，eNOS催化L-arg生成NO，NO可以活化可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，生成環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)，繼而激活PKG-1，產(chǎn)生舒張血管，抑制心肌細(xì)胞肥大等多種作用。本研究結(jié)果顯示MCT組大鼠右心室eNOS和PKG-1蛋白的表達(dá)均下調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)在MCT誘導(dǎo)的大鼠右心室重構(gòu)中，右心室eNOS的表達(dá)和/或PKG蛋白的表達(dá)下調(diào)[14-15]；朱鳴等[16]發(fā)現(xiàn)左心室重構(gòu)的發(fā)生與缺乏PKG密切相關(guān)。綜合以上分析，提示eNOS和PKG-1的表達(dá)被抑制與MCT所致大鼠右心室重構(gòu)相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道[17]，KMUP-1通過上調(diào)左心室組織eNOS蛋白的表達(dá)，使NO生成增多，繼而cGMP生成增多、PKG-1蛋白的表達(dá)升高，從而改善異丙腎上腺素所誘導(dǎo)的大鼠左心室重構(gòu)。本研究結(jié)果顯示：L-arg作為eNOS的底物供體，能抑制MCT所致的右心室組織eNOS和PKG-1蛋白的表達(dá)下調(diào)；而L-NAME作為eNOS的抑制劑能抑制L-arg的上述作用。綜合以上分析，L-arg可能通過增加eNOS的底物而促使NO生成增加，從而激活NO-cGMP-PKG信號通路；另一方面，L-arg還通過上調(diào)eNOS的表達(dá)，激活NO-cGMP-PKG信號通路，繼而改善MCT所致的右心室重構(gòu)。

綜上所述，L-arg具有改善MCT所致大鼠右心室重構(gòu)的作用，其機(jī)制可能與上調(diào)eNOS/PKG-1的信號通路有關(guān)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室完成！)