新型TSPO配體YL-IPA08抗創(chuàng)傷后應激障礙的大鼠血漿代謝譜的代謝組學研究

高 尤，姬海南，相亞楠，李 聰，張文鵬，張黎明，莊笑梅

(1. 軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，2. 中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100850)

創(chuàng)傷后應激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)是指個體在遇到不尋常的威脅或災難后出現(xiàn)的長期精神障礙。目前，獲美國FDA批準用于治療PTSD的藥物僅有五羥色胺重攝取類抑制劑(SSRIs)類別中的舍曲林和帕羅西汀。但是這些藥物具有效率低、起效遲緩和嚴重不良反應等問題，其臨床應用受到限制。目前中國無抗PTSD藥物上市[1]，因此研發(fā)抗PTSD新藥具有重要意義。

近幾年來，哺乳動物的18 KD轉位蛋白(18 KD translocator protein，TSPO)作為抗抑郁、抗焦慮、抗PTSD新型靶標備受關注。TSPO能夠介導膽固醇進入線粒體內(nèi)，是腦合成神經(jīng)類固醇并發(fā)揮神經(jīng)保護作用的關鍵蛋白[2]。YL-IPA08是結構全新且具有自主知識產(chǎn)權作用于TSPO的藥物，具有明確的抗PTSD作用(已獲得中國專利)，且無苯二氮卓類(BDZs)不良反應[3]。

研究表明腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)分泌減少和活性降低增加機體對PTSD的敏感性[4]。海馬法尼醇受體(FXR)過表達降低BDNF的表達并引起大鼠明顯的抑郁樣行為，而膽汁酸激活FXR表達。因此，膽汁酸的穩(wěn)態(tài)失衡是否與PTSD存在關聯(lián)值得關注[5]。代謝組學通過對體內(nèi)代謝物的定性定量分析，能夠揭示機體在正常生命狀態(tài)和內(nèi)外環(huán)境變化后代謝的變化規(guī)律[6]。本研究采用代謝組學技術，尋找與PTSD相關的生物標志物及可能受影響的代謝通路，并進一步在藥效明確的基礎上分析YL-IPA08對PTSD大鼠內(nèi)源代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用，闡明YL-IPA08治療PTSD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器設備YL-IPA08(純度≥99%，2019112203)由軍事醫(yī)學研究院合成，脫氧甘膽酸(GDCA)(BCBN5741V)、去氧膽酸(DCA)(074K0062)和熊去氧膽酸(UDCA)(074K080)購自美國Sigma公司，?；蛆Z去氧膽酸(TCDCA)(S380652)、牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)(S386503)、?；侨パ跄懰?TDCA)(S798604)、甘氨鵝去氧膽酸(GCDCA)(S579402)、石膽酸(LCA)(S400301)、甘氨膽酸(GCA)(S495804)、甘氨熊去氧膽酸(GUDCA)(S614605)和鵝去氧膽酸(CDCA)(S184301)購自Selleckchem公司，脫氫膽酸(DHLCA)(114k5322)、?；秦i去氧膽酸(THDCA)(SLBH 1208)、甘氨豬去氧膽酸(GHDCA)(SLBH2506)、甘氨石膽酸(GLCA)(1-TMH-13-4)和?；悄懰猁}水合物(TCA)(WA12504)購自美國Fluka公司，膽酸(CA)(SLBH1420V)和豬去氧膽酸(HDCA)(SLBH1120)購自中國藥品生物制品檢定所。電子天平購于北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，KQ-250 超聲波清洗器購于昆山市超聲儀器有限公司，離心機和Q Exactive Focus購于美國Thermo scientific公司，-80 ℃冰箱購于美國Thermo Fisher公司，凍干機購于美國LABCONCO公司、LCMS-8060購于日本SHIMADZU公司。

1.2 動物SD大鼠，♂，SPF級，體質(zhì)量(200-220) g，購自北京斯貝福實驗動物科技有限公司，許可證：SCXK(京)2011-0004。大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房中，適應性飼養(yǎng)7 d后按體質(zhì)量隨機分為對照組、模型組和治療組，每組10只。

1.3 YL-IPA08抗PTSD的行為學研究大鼠首先適應環(huán)境7 d，每天抓取3 min，以減少無關應激刺激對后續(xù)實驗操作的影響。實驗過程中，保證實驗環(huán)境的相對安靜。之后參照文獻[7]，構建經(jīng)典的PTSD行為模型-單程長時應激模型(SPS)，并在此模型上用高架十字迷宮實驗和開場實驗評價YL-IPA08抗PTSD的行為學效應。

1.4 非靶向代謝組學血漿樣品的檢測方法[8]色譜條件 Dionex Ultimate 3000 超高效液相色譜儀，色譜柱：Thermo Syncronis C18 (2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；液相條件：A：水，B：乙腈；梯度洗脫：0-1 min，95% A；1-5 min，95%-40% A；5-8 min，40%-0 A；8-11 min，0 A；11-14 min，0-40% A；11-15 min，40%-95% A；15-18 min，95% A。流速為0.3 mL·min-1。

質(zhì)譜條件 Q Exactive高分辨質(zhì)譜，噴霧離子源(ESI)，采用正負離子同時掃描模式；一級全掃描(Full scan)：分辨率：70 000；掃描范圍：70-1 050 m/z；二級數(shù)據(jù)依賴性掃描(Full MS/dd-MS)：分辨率：17 500。

1.5 大鼠血漿膽汁酸含量的檢測大鼠血漿25 μL加入1 000 μL甲醇，振蕩1 min，5×g離心10 min，小心吸取900 μL上清，揮干后，加入100 μL 50%甲醇復溶[9]，離心，取上清進樣檢測。色譜條件：A：水，B：甲醇：乙腈(1 ∶1)；梯度洗脫程序：2.00 min，40% B；2.50 min，45% B；3.50 min，50% B；4.60 min，55% B ；5.70 min，55% B；5.80 min，70% B；7.50 min，70% B；7.51 min，95% B；8.50 min，95% B；8.51 min，35% B；11.00 min。流速為0.5 mL·min-1。色譜柱：Shimadzu Shim-pack Velox SP-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)柱。電噴霧離子源(ESI)負離子SIM模式下采集數(shù)據(jù)。檢測m/z LCA：376.10、DCA：392.20、CDCA：392.20、UDCA：392.20、HDCA：392.30、CA：408.28、GLCA：433.30、GDCA：449.20、GCDCA：449.20、GUDCA：449.20、GHDCA：449.20、GCA：465.30、TDCA：499.20、TCDCA：499.30、TUDCA：499.30、THDCA：499.20、TCA：515.20、DHLCA：374.30。

2 結果

2.1 YL-IPA08抗PTSD的行為學研究與對照組相比，SPS后大鼠的僵住時間顯著延長(Tab 1)；在高架十字迷宮實驗中，SPS大鼠的開臂停留百分比與開臂停留次數(shù)明顯降低(Tab 2)，提示PTSD模型制備成功。慢性給予YL-IPA08后可逆轉上述行為學變化，表明YL-IPA08具有明顯的抗PTSD作用。同時，各組之間的開場活動差異無顯著性(Tab 3)。

Tab 1 Effect of YL-IPA08 on freezing time of

Tab 2 Effect of YL-IPA08 on elevated plus-maze behavior of

Tab 3 Effect of YL-IPA08 on open field of

2.2 大鼠血漿樣本總離子圖采用mzcloud對大鼠血漿內(nèi)源性代謝物質(zhì)進行鑒定，在Trace Finder軟件進行自建內(nèi)源性物質(zhì)[10]，血漿內(nèi)源性代謝物總離子圖見Fig 1，膽汁酸對照品和模型組中膽汁酸色譜圖見Fig 2。

Fig 1 Plasma total ion maps in rat plasma detected by full scan

Fig 2 Bile acids chromatogram maps of reference substance and model group in rat plasma

2.3 PCA和聚類分析用于各組血漿UPLC-MS數(shù)據(jù)的模式識別采用PCA對對照組、模型組和治療組進行分析，分析結果見Fig 3，由Scores圖可以看出，各組樣本均有集聚成群的趨勢，說明建模后體內(nèi)代謝物發(fā)生了明顯的改變，給與YL-IPA08后大鼠體內(nèi)代謝物狀態(tài)較模型組也發(fā)生了改變。

Fig 3 Plasma PCA scores of rats in treatment group, model group and control group

2.4 PTSD模型大鼠對血漿內(nèi)源性物質(zhì)代謝變化的影響采用PLS-DA分析方法對對照組、模型組和治療組血漿代謝組學數(shù)據(jù)進行分析，結果見Fig 4。通過PLS-DA方法對各組代謝物的差異進行分析，結果顯示各組樣本點相分離，且各樣本點在一定范圍內(nèi)聚集較好，說明建模后，從內(nèi)源代謝物的變化層面證明該模型建立成功。模型的Q2為0.71(R2X=0.927，R2Y=0.965)，即其中92.7%的變量被用來建立模型的主要成分，71%的樣本符合模型判別，模型的預測能力為96.5%。PLS-DA分析后，結合P<0.05及VIP>1的條件篩選出潛在的生物標志物。與文獻比較后，在大鼠血漿中鑒定出40個潛在的生物標志物信息見Tab 4，下一步將采用對照品對內(nèi)源性成分逐一確認。與對照組相比，模型組大鼠的L-脯氨酸、L-纈氨酸、L-精氨酸、膽酸、谷氨酸含量升高，L-亮氨酸、肌酸含量降低；而治療組大鼠的L-脯氨酸、L-纈氨酸、谷氨酸含量升高，L-精氨酸、L-亮氨酸、膽酸、肌酸含量降低(Tab 5)。

Fig 4 PLS-DA models metabolomic data of plasma samples

對大鼠血漿中差異代謝物進行相關性分析和分層聚類分析，發(fā)現(xiàn)差異性內(nèi)源性代謝物之間呈正相關性。對照組與其他各組明顯分開，并且治療組與對照組最接近，說明治療組對模型大鼠內(nèi)源代謝紊亂具有調(diào)節(jié)作用(Fig 5)。

應用靶向代謝組學方法，對各組的膽汁酸濃度進行定量測定，經(jīng)T檢驗分析，與對照組相比，模型組大鼠血漿中LCA、DCA、CDCA、UDCA、HDCA、CA、GCDCA、GCA、DHLCA、GUDCA、GDCA的含量呈上升趨勢，TDCA、THDCA、TCA的含量呈下降趨勢，治療組大鼠血漿中LCA、DCA、CDCA、UDCA、HDCA、CA、GDCA、GUDCA、GCA、TDCA、THDCA、TCA、DHLCA的含量無明顯變化。與模型組相比，治療組大鼠血漿中DCA、CDCA、UDCA、HDCA、CA、GCA、DHLCA、LCA的含量呈下降趨勢，TDCA、TCA的含量呈上升趨勢。提示PTSD模型大鼠血漿中膽汁酸的含量異常，給予YL-IPA08后，大鼠血漿中膽汁酸含量有明顯的回調(diào)。各組血漿樣品的膽汁酸濃度及統(tǒng)計學分析結果見Tab 6。

Tab 4 Differential metabolic substance spectrum information

2.5 YL-IPA08對PTSD模型潛在生物標志物代謝通路的調(diào)節(jié)利用Metabo Analyst網(wǎng)站對PTSD模型大鼠內(nèi)源代謝物進行代謝通路的富集分析，選擇KEGG作為數(shù)據(jù)庫，代謝通路影響值的臨界設置為0.10，高于0.10是潛在的靶標路徑，共得到5條PTSD模型相關的潛在代謝靶標路徑(Fig 6，Tab 7)。以上結果提示，PTSD模型大鼠體內(nèi)上述代謝通路可能受到了干擾。結合內(nèi)源代謝物的變化(Tab 5)提示，YL-IPA08可能通過調(diào)節(jié)上述代謝通路改善大鼠PTSD樣作用。

Tab 6 Influence of YL-IPA08 on plasma bile acid concentration of

Tab 7 Results from pathway analysis with MetPA (Impact>0.10)

Fig 5 (A) Relevant results of biomarker analysis, (B) Heatmap analysis of results of each group of related biomarkers (distance measure using Euclidean, and clustering algorithm using ward.D)

Fig 6 Summary of pathways analysis with MetPA

Tab 5 Mean changes of major endogenous metabolites in rat plasma of model and YL-IPA08 group compared with control group (VIP value>1)

3 討論

應用代謝組學技術研究PTSD的內(nèi)源代謝紊亂已有大量研究報道。暴露于戰(zhàn)斗創(chuàng)傷下的男性血漿代謝組學研究結果表明，PTSD可導致能量/碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝紊亂[11]。PTSD

模型大鼠代謝組學研究顯示線粒體功能受損，導致脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、能量代謝等異常[12]。YL-IPA08是治療PTSD的全新藥物，前期研究結果顯示藥效明確[3]，但如何調(diào)節(jié)PTSD導致的內(nèi)源代謝紊亂值得研究。

本研究應用LC-MS/MS技術支持的靶向和非靶向結合的代謝組學研究YL-IPA08對PTSD模型大鼠血漿中的內(nèi)源代謝的影響。結果表明，YL-IPA08有可能通過影響氨基酸、磷脂、花生四烯酸等代謝通路逆轉PTSD模型大鼠癥狀，其中谷氨酸代謝通路的相關性最大，脯氨酸和精氨酸等代謝也有影響。通過定量比較各組大鼠血漿中18種膽汁酸含量，發(fā)現(xiàn)YL-IPA08對PTSD模型大鼠的膽汁酸異常也有調(diào)節(jié)作用。

氨基酸分布于體內(nèi)各處，通過血液循環(huán)在各組織之間轉運參與代謝，構成氨基酸代謝庫，以保證組織對氨基酸代謝的需要。越來越多的證據(jù)表明，谷氨酸在情緒、焦慮和創(chuàng)傷相關障礙中的異常功能，谷氨酸神經(jīng)傳遞功能障礙越來越被認為是應激相關精神障礙(包括PTSD)的主要特征[13]。經(jīng)代謝通路拓撲分析，本研究中大鼠PTSD模型主要影響了谷氨酸代謝(impact>0.5)(Tab 7)。模型組大鼠血漿中谷氨酸升高，治療組大鼠血漿中谷氨酸有回調(diào)現(xiàn)象(Tab 5)，表明YL-IPA08可能通過調(diào)節(jié)谷氨酸異常升高緩解大鼠PTSD癥狀。

差異代謝物肌酸是與脯氨酸和精氨酸代謝通路相關的關鍵代謝產(chǎn)物。肌酸可作為能量緩沖劑和能量載體在組織(如大腦和骨骼肌)中提供動態(tài)能量需求[14]。研究表明PTSD模型大鼠的內(nèi)側前額葉皮質(zhì)肌酸水平下降，該區(qū)域的興奮性張力下降[15]。肌酸在腦能量穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用。本研究中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，PTSD模型組大鼠肌酸含量降低，治療組大鼠肌酸含量有回調(diào)現(xiàn)象，提示YL-IPA08可能通過改善大腦能量代謝發(fā)揮作用。

膽汁酸由膽固醇在肝細胞中轉化而來，是膽汁的主要成分，其在體內(nèi)的合成、轉運受到多種因素的調(diào)節(jié)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組PTSD大鼠血漿中11種膽汁酸(LCA、DCA、CDCA、UDCA、HDCA、CA、GCDCA、GCA、DHLCA、GUDCA、GDCA)含量明顯上升。文獻報道膽汁酸能夠激活FXR表達，而FXR的過度表達能降低腦源性神經(jīng)因子分泌和活性，從而增加機體對精神疾病(PTSD)的敏感性[4]。本研究結果提示膽汁酸的穩(wěn)態(tài)失衡可能導致了PTSD樣作用。給予YL-IPA08后，大鼠血漿中的膽酸含量有明顯的回調(diào)趨勢(Tab 6)，表明YL-IPA08能調(diào)節(jié)PTSD大鼠膽汁酸代謝紊亂。本研究還提示血漿中膽酸可作為YL-IPA08治療PTSD的潛在生物標志物。

綜上，應用代謝組學研究首次發(fā)現(xiàn)YL-IPA08對PTSD模型大鼠內(nèi)源代謝紊亂具有一定的干預作用，其機制可能與調(diào)節(jié)氨基酸代謝和膽汁酸代謝等有關。目前的結果可為深入研究YL-IPA08治療PTSD機制提供新線索。