ASXL1缺失對(duì)人白血病HEL細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

蔣 曉，肖方楠，劉怡寧，張明英，袁佳佳，邢 文，周 圓

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300020)

典型的費(fèi)城染色體(philadelphia chromosome，Ph)陰性骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms，MPNs)是造血干細(xì)胞惡性克隆性增殖并伴隨成熟細(xì)胞增多的一類(lèi)疾病，主要包括真性紅細(xì)胞增多癥(polycythemia vera，PV)、原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythemia，ET)和原發(fā)性骨髓纖維化(primary myelofibrosis，PMF)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，>95%的PV患者中都攜帶JAK2V617F的突變，且近60%的ET患者和50%的PMF患者也具有JAK2V617F突變。

JAK2是非受體蛋白酪氨酸激酶Janus激酶(JAKs)家族的成員，JAK活化可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和遷移，并且通過(guò)參與轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)途徑，影響多種細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程[3]，但是JAK2V617F突變?cè)?種不同表型Ph陰性MPN發(fā)病機(jī)制中的作用尚未完全清楚[4-5]。此外，對(duì)MPN患者的高通量基因組分析發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳調(diào)控因子如ASXL1、TET2、IDH、EZH2和DNMT3A等體細(xì)胞突變往往與JAK2突變共存[6]。其中，ASXL1在表觀遺傳調(diào)控中起著重要作用，目前幾乎在各種類(lèi)型的髓系惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了ASXL1突變，例如骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic，MDS)、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)和MPN等，其在MDS、MPN和AML中的突變頻率分別約為20%、10%和20%[7-8]。臨床研究表明，與僅攜帶JAK2V617F突變的PV患者相比，攜帶ASXL1和JAK2V617F共突變的患者血紅蛋白(Hb)水平降低，白細(xì)胞(WBC)和血小板(PLT)計(jì)數(shù)增加，可觸及脾腫大，克隆性異常核型，其生存預(yù)后更差[9-11]。

已知ASXL1突變和JAK2V617F共存對(duì)MPN的發(fā)病有顯著影響，但ASXL1突變?nèi)绾未龠M(jìn)JAK2V617F突變導(dǎo)致的MPN疾病進(jìn)展和預(yù)后不良尚不清楚。因此，本研究以攜帶JAK2V617F純合突變的人紅白血病細(xì)胞系HEL為模型，利用CRISPR-Cas9技術(shù)建立了HEL-AKO細(xì)胞系，為在細(xì)胞水平上闡明ASXL1功能缺失性突變與JAK2V617F協(xié)調(diào)參與MPN進(jìn)展的作用機(jī)制提供了重要工具。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器HEL是JAK2V617F突變陽(yáng)性的人紅白血病細(xì)胞系，購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室保存。培養(yǎng)條件為含10% FBS的RPMI1640。

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自以色列Biological Industries公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)購(gòu)自索萊寶公司；Cell Counting Kit-8購(gòu)自日本Dojindo Laboratories公司；蘆可替尼購(gòu)自MCE；CFC半固體培養(yǎng)(MethoCult H4230)購(gòu)自StemCell Technologies公司；流式細(xì)胞儀Canto II購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司；常溫臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立ASXL1敲除的HEL細(xì)胞系

1.2.1病毒包裝 靶向人ASXL1基因的guide RNA序列為5′-CAGATTCTGCAGGTCATA-3′，包裝載體 psPAX2、pCMV-VSV-G以及目的質(zhì)粒配制混合液，配制方法如下表所示，將混合液緩慢逐滴加入鋪好的293T細(xì)胞(1×107cells)，收集24和48 h病毒上清，超離濃縮，進(jìn)行滴度測(cè)定后即可對(duì)HEL細(xì)胞進(jìn)行感染，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108L-1，根據(jù)病毒滴度，用含有Polybrene(終濃度5 mg·L-1)的培養(yǎng)基配制病毒混合懸液，進(jìn)行一次感染，8 h后撤Polybrene，更換為新鮮培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)后進(jìn)行二次培養(yǎng)。

1.2.2HEL細(xì)胞分選、測(cè)序 將經(jīng)過(guò)二次病毒感染后的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)3 d。配制含嘌呤霉素(終濃度4 mg·L-1)的培養(yǎng)基，繼續(xù)用含嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩5-7 d。將篩選完的HEL細(xì)胞的進(jìn)行單細(xì)胞分選，放置1周左右，等克隆長(zhǎng)大，即可轉(zhuǎn)出，根據(jù)每板克隆的生長(zhǎng)情況，挑選相對(duì)較大的單細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)出，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取DNA，測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果，即可挑出目的克隆。

1.2.3細(xì)胞STR檢驗(yàn) 取適量檢材用Microread Genomic DNA Kit 提取DNA，采用MicroreaderTM21 ID System擴(kuò)增20個(gè)STR位點(diǎn)和性別鑒定位點(diǎn)，使用ABI 3730xl型遺傳分析儀進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測(cè)，使用GeneMapperID-X 軟件(Applied Biosystems)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，并與ATCC和DSMZ數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

1.3ASXL1敲除對(duì)HEL細(xì)胞增殖能力的影響根據(jù)Life technologies Cell Trace Violet Cell Proliferation Kit操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別取出1×106生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEL Control及HEL-AKO細(xì)胞系，細(xì)胞數(shù)根據(jù)細(xì)胞的增殖速度和檢測(cè)的間隔時(shí)間決定。每1 mL細(xì)胞液(1×106)加入1 μL 5 mmol·L-1染色液進(jìn)行染色。剩余細(xì)胞37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)取出細(xì)胞并用4% PFA固定，待所有時(shí)間點(diǎn)取完后一同進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.4 HEL-AKO細(xì)胞的體外遷移實(shí)驗(yàn)采用24孔板的Transwell小室(8 μm微孔)，取1×105生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEL Control以及HEL-AKO細(xì)胞，加入到100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基的上層Transwell小室中，在下室加入900 μL完全培養(yǎng)基，孵育24 h后，用4% PFA固定小室下表面上已經(jīng)遷移過(guò)去的細(xì)胞后用0.1%結(jié)晶紫染色，在顯微鏡低下統(tǒng)計(jì)5個(gè)隨機(jī)視野中遷移過(guò)去的細(xì)胞。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期收集提前處理24 h的HEL Control以及HEL-AKO細(xì)胞系，參考碧云天BeyoClickTMEdU-647細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，處理完細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.6ASXL1敲除對(duì)HEL細(xì)胞克隆形成能力的影響分別收集HEL Control以及HEL-AKO細(xì)胞，制備成10×細(xì)胞懸液，分別取100 μL加至1.2 mL H4230甲基纖維素中，使最終每孔細(xì)胞數(shù)為300個(gè)，用注射器將混勻的細(xì)胞加入24孔板中，3個(gè)重復(fù)孔。14 d后計(jì)數(shù)CFC數(shù)目，并用0.05%甲紫染色，掃描儀掃描。

1.7 HEL-AKO細(xì)胞對(duì)蘆可替尼藥物敏感性檢測(cè)采用CCK-8法測(cè)定蘆可替尼處理72 h后對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50(half maximal inhibitory concentration)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEL和HEL-AKO細(xì)胞，用含有20%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為8×107個(gè)·L-1，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔90 μL；處理組加不同濃度的藥物，陰性對(duì)照組加等體積的藥物溶劑，使每孔終體積為100 μL。培養(yǎng)72 h后，加入CCK-8在酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm光密度(OD)值，并計(jì)算生長(zhǎng)的抑制率。在GraphPad Prism7.0軟件中，以同一藥物的不同濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線(xiàn)，求出該藥物的半數(shù)抑制濃度IC50，即細(xì)胞存活率減少50% 時(shí)的藥物劑量。采用克隆形成法檢測(cè)蘆可替尼處理24 h后，HEL Control和HEL-AKO細(xì)胞在14 d后耐藥克隆的形成情況，具體方法參照“1.6”。

2 結(jié)果

2.1ASXL1敲除細(xì)胞的構(gòu)建與鑒定選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEL細(xì)胞，分別感染攜帶pRSC-sgControl和pRSC-sgASXL1質(zhì)粒的慢病毒。單克隆測(cè)序結(jié)果證明，HEL Control的DNA序列未發(fā)生任何變化，HEL-AKO的DNA序列發(fā)生13個(gè)堿基的缺失(GGTCATAGAGGCA)，第36個(gè)氨基酸發(fā)生移碼突變，編碼出38個(gè)氨基酸(Glu36TrpfsX38)(Fig 1A)?？紤]到CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可能存在脫靶，我們利用https://ccg.epfl.ch//tagger/tagscan.html網(wǎng)站檢測(cè)one mismatch和two mismatch可能脫靶基因，并挑選位于編碼區(qū)的基因，設(shè)計(jì)引物，在HEL-AKO細(xì)胞中進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，均未發(fā)現(xiàn)脫靶(Fig 1B)，本文中僅列舉出one mismatch測(cè)序結(jié)果。細(xì)胞STR結(jié)果檢測(cè)HEL細(xì)胞DNA擴(kuò)增后圖譜清晰，分型結(jié)果良好，細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其它細(xì)胞交叉污染，與ATCC中HEL 92.1.7 ErythroleukemiaHuman細(xì)胞的STR數(shù)據(jù)匹配率為83%。該細(xì)胞的STR位點(diǎn)和Amelogenin位點(diǎn)的基因分型圖譜見(jiàn)附圖(Fig 1C)。

2.2ASXL1基因敲除對(duì)HEL細(xì)胞系的增殖能力和細(xì)胞周期的影響為了探究ASXL1敲除之后是否會(huì)對(duì)HEL的增殖能力產(chǎn)生影響，我們利用CFSE實(shí)驗(yàn)以及克隆形成能力檢測(cè)了其增殖能力，比較發(fā)現(xiàn)HEL-AKO細(xì)胞的增殖能力變慢(Fig 2A、B)。為進(jìn)一步了解ASXL1缺失對(duì)細(xì)胞周期的影響，我們使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，結(jié)果顯示ASXL1敲除之后其細(xì)胞周期的G2/M期占整個(gè)細(xì)胞周期的比例增加，G0/G1期和S期均不受影響(Fig 2C)，此結(jié)果表明ASXL1可能是通過(guò)影響細(xì)胞周期的G2/M期來(lái)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)。

Fig 1 HEL-AKO cell line established by CRISPR/Cas9 technology

2.3 檢測(cè)ASXL1敲除對(duì)HEL細(xì)胞克隆形成能力和遷移能力的影響為進(jìn)一步了解ASXL1敲除后對(duì)HEL細(xì)胞克隆形成能力的影響，我們隨后又進(jìn)行了半固體克隆形成能力實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，ASXL1敲除之后，與對(duì)照組相比，HEL-AKO細(xì)胞的克隆形成變小且克隆數(shù)降低(Fig 3A、B)。如Fig 3C所示，HEL-AKO細(xì)胞的遷移能力與對(duì)照組相比明顯增強(qiáng)。

2.4 HEL-AKO細(xì)胞經(jīng)蘆可替尼處理后耐藥克隆增加蘆可替尼作為唯一治療中期或高風(fēng)險(xiǎn)骨髓纖維化的JAK2選擇性抑制劑，具有明顯的臨床活性，因此我們又測(cè)定了蘆可替尼對(duì)HEL-AKO細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。結(jié)果表明，液體培養(yǎng)72 h條件下蘆可替尼對(duì)HEL和HEL-AKO的半數(shù)致死劑量分別是2.058 μmol·L-1和2.13 μmol·L-1(Fig 4A)，為了進(jìn)一步考察藥物處理后對(duì)細(xì)胞的長(zhǎng)期影響，我們利用克隆形成實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)ASXL1敲除后HEL細(xì)胞的耐藥克隆形成能力。選取對(duì)對(duì)照組細(xì)胞殺傷性較低的藥物劑量處理細(xì)胞24 h(2 μmol·L-1Ruxolitinib)，用PBS洗去殘余藥物后重新計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，以相同體積細(xì)胞接種到0.4 mL H4230半固體培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)14 d后觀察形成的耐藥克隆的數(shù)目(Fig 4B)。其結(jié)果顯示，藥物處理后過(guò)表達(dá)HEL-AKO細(xì)胞形成的耐藥克隆數(shù)目明顯高于對(duì)照組，這說(shuō)明藥物處理后ASXL1缺失的白血病細(xì)胞對(duì)蘆可替尼仍然具有較強(qiáng)的克隆形成能力。

Fig 2 Effects of ASXL1 knockout on proliferation and cell cycle of HEL cell lines n=2)

Fig 3 Clone formation ability of HEL-AKO cells n=2)

Fig 4 Effects of ruxolitinib on cloning formation ability of HEL-AKO cells n=2)

3 討論

ASXL1突變?yōu)镴AK1V617F突變陽(yáng)性MPN中最常見(jiàn)的共突變基因之一，且共突變患者發(fā)生骨髓纖維化比例更高，疾病進(jìn)展更快，且與疾病進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)，但ASXL1與JAK2V617F協(xié)同作用參與MPN的內(nèi)在機(jī)制尚無(wú)報(bào)道，本研究基于這一背景，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功建立了ASXL1基因敲除的HEL細(xì)胞系(HEL-AKO)。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ASXL1缺失后的HEL細(xì)胞的遷移能力變強(qiáng)，增殖能力變慢，細(xì)胞周期G2/M期進(jìn)程延長(zhǎng)，克隆形成能力減弱，在耐藥實(shí)驗(yàn)中，HEL-AKO細(xì)胞對(duì)蘆可替尼表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐藥性。蘆可替尼作為一種JAK1和JAK2抑制劑，是MPN治療中所應(yīng)用的重要靶向藥物，可以通過(guò)減少脾臟大小，改善骨髓纖維化的相關(guān)癥狀，并提高M(jìn)PN患者總體生存期[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，ASXL1缺失與JAK2V617F共存時(shí)的HEL細(xì)胞較單獨(dú)JAK2V617F突變的細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的蘆可替尼耐藥性。ASXL1作為重要的表觀遺傳因子，主要通過(guò)影響組蛋白修飾水平發(fā)揮作用，例如H3K27me3和H3K4me3等。另外，研究表明，JAK2除了激活JAK-STAT等信號(hào)通路，其自身也參與表觀遺傳調(diào)節(jié)，直接影響組蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾，從而參與染色質(zhì)修飾過(guò)程，造成原癌基因例如HOX基因上調(diào)[14-15]，而這些HOX基因也大多正是ASXL1敲除后表達(dá)上調(diào)的基因，這提示我們ASXL1突變很有可能與JAK2V617F協(xié)同影響組蛋白修飾，影響特定的基因表達(dá)，進(jìn)而影響了對(duì)蘆可替尼的耐藥性。此外，ASXL1被國(guó)際預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)認(rèn)為是PMF預(yù)后相關(guān)的獨(dú)立不良預(yù)后因素[16]，是否ASXL1缺失導(dǎo)致蘆可替尼耐藥也是其影響預(yù)后的重要原因。關(guān)于ASXL1缺失引起的耐藥也可能涉及其他多種機(jī)制，有研究表明白血病細(xì)胞的多藥耐藥機(jī)制與自噬水平密切相關(guān)，也可作為重要的切入點(diǎn)之一[17]。

由此可見(jiàn)，ASXL1的缺失對(duì)HEL-AKO細(xì)胞的生物學(xué)特性具有非常重要的影響，下一步我們將利用本細(xì)胞模型，結(jié)合小鼠模型及患者原代標(biāo)本，深入闡明ASXL1與JAK2V617F突變協(xié)同參與MPN的分子機(jī)制，尋找新的藥物靶點(diǎn)和藥物治療組合，為臨床實(shí)踐提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。