胞外和胞內(nèi)菌胞外囊泡的功能及應(yīng)用

王永玉， 徐兆坤， 馬春驥， 郝秀靜， 李 敏， 羅海霞

(寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021)

細(xì)胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs) 是從細(xì)胞膜上脫落或者分泌的雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡狀小體[1-2]，真核生物、細(xì)菌及古細(xì)菌等絕大多數(shù)具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物，均可以分泌EVs。根據(jù)囊泡的大小，EVs可分為多種亞群[3]，如微囊泡、微粒、外泌體、凋亡小體、包膜病毒、外泌顆粒等(表1)。國際上對這些細(xì)胞外囊泡的命名比較繁雜，包括exosomes、extracellular vehicles (EVs)、outer membrane vesicles (OMVs)、membrane vesicles (MVs)、Micro-vesicles、microparticles和cytoplasmic membrane vesicles (CMVs)等[4-5]。本文使用“細(xì)胞外囊泡(EVs)”表述這些細(xì)胞外囊泡結(jié)構(gòu)。細(xì)菌細(xì)胞釋放的具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡，即細(xì)菌胞外囊泡(EVs)，其中包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和代謝物等多種成分，這使EVs在細(xì)菌核酸水平轉(zhuǎn)移、免疫逃逸、抗噬菌體和耐藥性以及在調(diào)節(jié)宿主免疫，感染和入侵宿主細(xì)胞等方面起著重要作用[6]。胞外菌是一類寄居在宿主細(xì)胞外的細(xì)菌，侵入機(jī)體后在組織間隙和體液中繁殖與擴(kuò)散，通過分泌毒素對機(jī)體造成損傷。常見的胞外菌有葡萄球菌、鏈球菌、腦膜炎球菌、淋球菌、厭氧芽胞梭菌和多種革蘭陰性桿菌等。胞內(nèi)菌是一類能夠侵入宿主細(xì)胞內(nèi)，并能在細(xì)胞內(nèi)生長和增殖的細(xì)菌，常潛伏于機(jī)體內(nèi)或引起機(jī)體長期慢性感染。布魯氏菌、志賀氏菌、結(jié)核分枝桿菌、單核李斯特菌、馬紅球菌等均為胞內(nèi)菌?，F(xiàn)有研究顯示胞外菌和胞內(nèi)菌的EVs在釋放機(jī)制、功能及臨床應(yīng)用等方面具有區(qū)別與聯(lián)系[7-9]，本文就此對近年來胞外菌和胞內(nèi)菌EVs的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

表1 細(xì)胞外囊泡的亞群和大小

1 細(xì)菌分泌EVs機(jī)制

細(xì)菌EVs的分泌機(jī)制是近年來的研究熱點(diǎn)，但目前大部分細(xì)菌EVs的分泌機(jī)制是基于研究提出的猜想。細(xì)菌EVs分泌機(jī)制包括以下四種說法：①EVs通過細(xì)菌外膜起泡形成[10]。革蘭陰性菌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性依賴于外膜與細(xì)胞質(zhì)膜間的脂蛋白與肽聚糖的共價(jià)連接，以及PG和肽聚糖相關(guān)脂蛋白(Peptidoglycan-associated lipoprotein, Pal)復(fù)合物之間的非共價(jià)相互作用。由于外膜與細(xì)胞質(zhì)膜間的周質(zhì)空間中肽聚糖片段或錯誤折疊蛋白質(zhì)的積累在外膜上施加膨脹的壓力，或者胞內(nèi)肽酶減弱了Braun脂蛋白與肽聚糖之間的共價(jià)連接，這些因素使得外膜與肽聚糖之間共價(jià)鍵連接和非共價(jià)相互作用的減弱或喪失，導(dǎo)致外膜與肽聚糖層之間出現(xiàn)空隙，外膜起泡并最終夾斷，由此導(dǎo)致OMVs的釋放[10-11]，以上途徑產(chǎn)生的EVs包含外膜及周質(zhì)空間的成分而不含細(xì)胞質(zhì)，被稱為外膜囊泡(Outer membrane vesicles, OMVs)[12-13]。②內(nèi)溶素降解細(xì)胞壁。研究顯示枯草芽胞桿菌產(chǎn)生的細(xì)胞質(zhì)膜囊泡(Cytoplasmic membrane vesicles, CMV)的冷凍電子斷層掃描圖像顯示，囊泡攜帶內(nèi)溶素，其能降解細(xì)菌含肽聚糖的細(xì)胞壁，一旦肽聚糖被降解，細(xì)菌很容易破碎裂解，并且破碎的膜片段向上聚集并自組裝成外-內(nèi)膜囊泡(outer-inner membrane vesicles, OIMVs)和爆炸性外膜囊泡(Explosive outer- membrane vesicles, EOMVs)，或者細(xì)胞質(zhì)膜通過細(xì)胞壁孔突出，形成CMV[8，14]。③EVs從細(xì)胞質(zhì)膜上釋放后，通過壓力擠壓發(fā)生形變，穿過細(xì)胞壁，細(xì)胞壁的孔徑或厚度可調(diào)節(jié)EVs的分泌[15]，Brown等[9]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌細(xì)胞壁含有通道蛋白，EVs通過形變可通過直徑比較窄的通道蛋白孔道。④EVs含有細(xì)胞壁降解酶。例如在金黃色葡萄球菌EVs中發(fā)現(xiàn)的肽聚糖水解酶N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰氨酶能夠通過增加細(xì)胞壁的通透性釋放EVs[16-17]。此外，細(xì)菌EVs的分泌還受到環(huán)境的影響，例如溫度、營養(yǎng)物質(zhì)、群體感應(yīng)和作用于細(xì)菌細(xì)胞膜的抗生素等因素[18]，其相關(guān)機(jī)制仍未被徹底闡明，需進(jìn)一步的研究。

2 感染細(xì)胞后胞內(nèi)菌EVs的釋放機(jī)制

胞內(nèi)致病菌感染宿主細(xì)胞后，不僅能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)存活并增殖，還能分泌EVs到宿主細(xì)胞內(nèi)，并通過胞吐的方式釋放到胞外。Guidi等[19]研究發(fā)現(xiàn)感染了鼠傷寒沙門氏菌的上皮細(xì)胞上清中的外泌體含有細(xì)胞致死性擴(kuò)張毒素(Cytolethal distending toxin, CDT)和鼠傷寒沙門氏菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，這間接說明了細(xì)胞上清中可能含有致病菌分泌的EVs，并包含致病菌的毒力因子。隨后Athman等[20]通過結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞上清中EVs包含兩個(gè)成分截然不同的類群：一類包含宿主細(xì)胞標(biāo)記(CD9、CD63)，另一類包含結(jié)核分枝桿菌相關(guān)成分(脂多糖、脂蛋白)。Jung等[21]的研究證明，當(dāng)致病菌感染宿主細(xì)胞后，細(xì)胞上清中的EVs含有宿主細(xì)胞成分和細(xì)菌成分，此時(shí)EVs來自兩個(gè)亞群：細(xì)胞來源和細(xì)菌來源。如圖1所示，胞內(nèi)菌感染宿主細(xì)胞后，在宿主細(xì)胞內(nèi)仍能夠分泌細(xì)菌本身的EVs并通過膜泡運(yùn)輸?shù)姆绞结尫诺剿拗骷?xì)胞外，宿主細(xì)胞自身也能夠通過形成多泡體(multivesicular body，MVB)進(jìn)而釋放細(xì)胞來源的EVs。因此，從病原菌感染宿主細(xì)胞后的上清液中能夠收集到宿主細(xì)胞來源和病原菌來源的EVs，鑒別兩種來源的EVs并對其進(jìn)行功能研究具有重要的意義。

圖1 感染細(xì)胞后胞內(nèi)菌EVs的釋放Fig.1 Release of intracellular bacteria EVs after infected cells

3 細(xì)菌EVs的功能

細(xì)菌分泌的EVs具有多種功能及應(yīng)用。如圖2所示，其不僅能調(diào)控宿主細(xì)胞基因表達(dá)，抑制宿主免疫反應(yīng)以及殺傷宿主細(xì)胞，還能夠促進(jìn)細(xì)菌自身基因的水平轉(zhuǎn)移、營養(yǎng)獲取、信息傳遞、介導(dǎo)病原菌免疫逃逸。且EVs在臨床應(yīng)用中也扮演著重要角色，如作為藥物遞送的載體以及作為良好的潛在疫苗等。功能的多樣性和應(yīng)用的廣泛性使得細(xì)菌EVs的研究具有重要意義。

3.1 細(xì)菌EVs組分對宿主細(xì)胞的作用

胞外菌和胞內(nèi)菌EVs含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸等多種成分，對宿主細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用。細(xì)菌EVs能與宿主細(xì)胞膜融合[22]，并直接與宿主細(xì)胞表面上的受體相互作用以啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳遞，并使細(xì)胞發(fā)生強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)甚至死亡[23-25]。細(xì)菌EVs中含有細(xì)菌來源的DNA與RNA，能夠在細(xì)菌間傳遞遺傳信息，還能夠與宿主細(xì)胞中特異性的小分子結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)或沉默基因表達(dá)等功能[26]。此外，EVs含有白細(xì)胞毒素、腺苷酸環(huán)化酶溶血素、脂多糖(LPS)等大量毒力因子，能夠?qū)λ拗骷?xì)胞起殺傷作用。EVs中發(fā)現(xiàn)了能夠促進(jìn)細(xì)菌侵襲及毒力因子擴(kuò)散作用的物質(zhì)，包括破壞宿主細(xì)胞外基質(zhì)(Extra-cellular matrix, ECM)的膠原酶和透明質(zhì)酸酶，有助于破壞物理屏障的絲氨酸蛋白酶例如脫落性毒素[27-28]。綜上所述，細(xì)菌分泌的EVs對宿主細(xì)胞起調(diào)節(jié)作用，包括調(diào)節(jié)或沉默基因表達(dá)、促進(jìn)炎癥信號傳導(dǎo)、對宿主細(xì)胞殺傷作用等。

3.2 胞外菌EVs介導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制

胞外菌能夠黏附在上皮表面并釋放毒性物質(zhì)引起局部化膿性炎癥，宿主主要靠體液免疫產(chǎn)生抗體并協(xié)同吞噬細(xì)胞識別將其清除。胞外菌EVs能夠抑制宿主的體液免疫。①抑制補(bǔ)體途徑。Olaya等研究發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌分泌的EVs包含的溶血素[29]不僅引起宿主細(xì)胞炎性反應(yīng)，還可以進(jìn)入到上皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中并與補(bǔ)體蛋白結(jié)合，導(dǎo)致補(bǔ)體介導(dǎo)的吞噬作用被抑制，從而促進(jìn)肺炎鏈球菌的免疫逃逸[30]。②誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡并降解抗生素。蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了金黃色葡萄球菌EVs中含有α-溶血素和β-內(nèi)酰胺酶，含有α-溶血素的金黃色葡萄球菌MVs能夠?qū)е滤拗骷t細(xì)胞溶解的同時(shí)又能夠誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡，并且當(dāng)外源加入青霉素時(shí)，其EVs中的β-內(nèi)酰胺酶可以降解青霉素以保護(hù)自身免受抗生素的破壞[31-32]。③抑制中性粒細(xì)胞的殺傷作用。中性粒細(xì)胞在感染早期清除胞外菌的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其通常通過吞噬微生物和分泌抗微生物劑兩種策略殺死入侵的病原菌。Brinkmann等確定了中性粒細(xì)胞的第三個(gè)功能：NETs(Neutrophil extracellular traps)的形成[33]。NETs主要由中性粒細(xì)胞的DNA組成，其能夠結(jié)合病原菌并允許中性粒細(xì)胞殺死胞外菌，同時(shí)最小化其對宿主細(xì)胞的損害[33-34]。從肺炎鏈球菌中分離的EVs通過免疫印跡發(fā)現(xiàn)EVs中存在一種高度保守的脫氧核糖核酸酶TatD，TatD具有核苷酸序列非依賴性內(nèi)切脫氧核糖核酸酶活性能夠有效降解NETs，從而逃避中性粒細(xì)胞殺死胞外菌[35]。④激活B細(xì)胞避免體液反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌OMVs能刺激B細(xì)胞并使B細(xì)胞表面分子CD69和CD86的上調(diào)，以及IgM和IgG分泌的增加，但免疫球蛋白并不能識別病原菌，于是OMVs以獨(dú)立于T細(xì)胞的方式促進(jìn)B細(xì)胞活化以轉(zhuǎn)移體液免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)宿主內(nèi)細(xì)菌的存活[36]。這一系列實(shí)驗(yàn)證明了胞外菌EVs能夠通過各種方式達(dá)到免疫逃逸的目的。

圖2 細(xì)菌細(xì)胞外囊泡的病理生理功能Fig.2 Pathophysiological functions of bacterial extracellular vesicles

3.3 胞內(nèi)菌EVs介導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制

胞內(nèi)菌能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)存活而不受體液免疫的影響，宿主細(xì)胞只能通過細(xì)胞免疫應(yīng)答對其進(jìn)行清除。病原菌也具有一系列免疫逃逸機(jī)制避免被宿主細(xì)胞識別和清除，EVs在病原菌免疫逃逸方面也發(fā)揮重要作用。胞內(nèi)菌的固有免疫主要依賴于吞噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷作用[37]。胞內(nèi)菌侵入機(jī)體后，能夠被巨噬細(xì)胞吞噬，胞內(nèi)菌也能通過各種機(jī)制抵抗巨噬細(xì)胞對其的殺傷作用并隱匿其中，胞內(nèi)菌EVs在這一過程發(fā)揮著巨大作用，主要包括：①EVs促進(jìn)胞內(nèi)菌復(fù)制。白介素1受體相關(guān)激酶1(Interleukin-1 receptor associated kinases 1,IRAK-1)介導(dǎo)NF-κB的下游激活，在Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)和IL-1R信號傳導(dǎo)中至關(guān)重要。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)嗜肺軍團(tuán)菌EVs能刺激巨噬細(xì)胞，并導(dǎo)致巨噬細(xì)胞TLR2和NF-κB依賴的微小RNA-146a(miRNA-146a)的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，導(dǎo)致白介素1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)有效降解，從而導(dǎo)致嗜肺軍團(tuán)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[38-39]。②EVs抑制T細(xì)胞活化。研究證明，結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌囊泡中的脂多糖被轉(zhuǎn)移至T細(xì)胞，抑制T細(xì)胞反應(yīng)，從而促進(jìn)了免疫逃逸[40]。③EVs抑制細(xì)胞自噬。一項(xiàng)研究顯示單核細(xì)胞性李斯特菌EVs中的某一蛋白會阻斷自噬機(jī)制的早期信號傳導(dǎo)，并抑制李斯特菌溶血素O(listeriolysin O， LLO)誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)致病菌存活，但EVs并不會影響正常的細(xì)胞自噬，尚不清楚是哪一種蛋白抑制了細(xì)胞自噬。

EVs在介導(dǎo)細(xì)菌免疫逃逸方面發(fā)揮重要作用，但胞內(nèi)菌與胞外菌EVs在介導(dǎo)免疫逃逸機(jī)制上存在共有和特有的方式。二者共有方面包括：二者都能夠抑制T細(xì)胞活化。胞內(nèi)菌金黃色葡萄球菌EVs中含有α-溶血素，能夠誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡。胞外菌腦膜炎球菌OMVs中的opacity-associated (Opa)蛋白通過與CD4+T細(xì)胞上的人類癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1, CEACAM1)結(jié)合，在感染部位建立免疫抑制區(qū)以抑制T細(xì)胞活化和增殖[41]。胞外菌特有方面包括：①抑制補(bǔ)體途徑；②抑制中性粒細(xì)胞的殺傷作用。胞內(nèi)菌特有方面包括：①EVs促進(jìn)胞內(nèi)菌復(fù)制；②EVs抑制細(xì)胞自噬；③激活B細(xì)胞避免體液反應(yīng)。研究證明胞內(nèi)菌與胞外菌EVs在介導(dǎo)免疫逃逸機(jī)制上既相似又存在著區(qū)別，前者主要參與體液免疫過程，后者主要參與細(xì)胞免疫過程。由此可見， 只有更全面地表征不同類型的EVs膜表面和囊泡內(nèi)部的成分，才能進(jìn)一步揭示病原菌的致病機(jī)制。

3.4 細(xì)菌EVs介導(dǎo)的其他功能

除了介導(dǎo)病原菌宿主的免疫殺傷，細(xì)菌EVs還具有如下功能：①清除細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的錯誤折疊蛋白或細(xì)胞內(nèi)不需要的成分[42]；②將毒力因子摻入EVs中遞送到宿主細(xì)胞，引起宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)，但細(xì)菌一般不會把黏附因子摻入EVs，可能為了避免與細(xì)菌競爭黏附細(xì)胞[43]；③從環(huán)境中獲取營養(yǎng)物質(zhì)，例如腦膜炎球菌的EVs富含鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FetA和FetB，能夠富集環(huán)境中的鐵以供致病菌的鐵元素獲取[44]；④通過EVs殺死競爭細(xì)菌以促進(jìn)自身生存[45]；⑤介導(dǎo)細(xì)菌DNA的水平轉(zhuǎn)移[46-47]；⑥通過運(yùn)輸對細(xì)菌自身有益的蛋白質(zhì)(如血紅素載體蛋白HmuY)促進(jìn)生物膜的形成[48-49]；⑦細(xì)菌EVs還介導(dǎo)對特定抗生素的群體抗性。有研究[50]表明，在大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的EVs釋放后，EVs具有通過吸附抗生素和噬菌體促進(jìn)細(xì)菌防御的作用，使細(xì)菌能夠存活于致死濃度的抗生素中，EVs的蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了蛋白酶和肽酶的存在，這些蛋白酶和肽酶似乎參與了該過程，并且還發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的EVs形成了針對特定抗生素的共同防御[51]。

隨著對細(xì)菌EVs的深入研究，越來越多的功能被發(fā)現(xiàn)和證明，這些細(xì)菌的EVs就像是一個(gè)個(gè)“快遞包裹”一樣維持著細(xì)菌與細(xì)菌、細(xì)菌與宿主之間的聯(lián)系。同時(shí)，細(xì)菌EVs成分的多樣性使其參與了細(xì)菌存活、侵襲、死亡等多個(gè)過程并發(fā)揮重要作用。然而，不同細(xì)菌所分泌的EVs之間功能的差異，不同方式分泌的EVs成分的差異，不同的EVs分離手段帶來的差異等方面仍需進(jìn)一步研究，從而為醫(yī)學(xué)的進(jìn)步與發(fā)展提供參考。

4 細(xì)菌EVs的臨床應(yīng)用

4.1 作為藥物遞送的載體

細(xì)菌EVs作為細(xì)菌與宿主細(xì)胞物質(zhì)交換的媒介，能夠長距離運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)和RNA等成分[13，52-53]，這使得細(xì)菌EVs具有遞送有治療功能的核酸、多肽、脂類或小分子藥物的潛能[54]。研究通常利用弱毒或無毒細(xì)菌(如大腸埃希菌)EVs，并通過基因突變的方式抑制細(xì)菌LPS表達(dá)或者使LPS中的類質(zhì)A?；蛔悖缓笸ㄟ^遺傳和表面修飾來靶向目標(biāo)細(xì)胞以及通過電穿孔的方法加載治療性藥物，從而治療疾病。EVs可遞送的藥物類型包括：①小干擾RNA(siRNA)。由于在乳腺癌、卵巢癌、胃癌等細(xì)胞中觀察到人表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor, HER2)的過表達(dá)，Gujrati等[55]在具有低免疫原性的大腸埃希菌突變株的EVs膜上插入HER2作為配體，通過電穿孔的方法使其攜帶治療性siRNA，在將重組EVs注射到小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)其能殺死小鼠癌細(xì)胞并使腫瘤消退，且修飾后的EVs具有良好的穩(wěn)定性和安全性。②小分子化合物。還有研究使用生物工程改造的大腸埃希菌MVs作為藥物遞送載體，通過MVs表面表皮生長因子受體(growth factor receptor, GFR)作為靶向配體，且內(nèi)裝載有抗腫瘤藥物阿霉素(Adriamycin)或伊達(dá)比星(Idarubicin)，由于上皮腫瘤細(xì)胞會過度表達(dá)GFR，所以在小鼠體內(nèi)EVs能夠靶向并殺死腫瘤細(xì)胞，展現(xiàn)了良好的治療效果，且小鼠并無體重、體溫及白細(xì)胞水平的異常[56]。

生物工程改造的EVs具有作為藥物遞送載體的潛力及以下優(yōu)點(diǎn)：①具有生物相容性和低免疫原性；②具有高物理化學(xué)穩(wěn)定性；③長距離及靶向運(yùn)輸能力；④穿越生物屏障(如血-腦屏障)等。但是，基于EVs的藥物遞送載體的開發(fā)仍然面臨挑戰(zhàn)，包括缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的分離和純化方法、EVs產(chǎn)量較低、藥物加載效率低、成本太高以及一定潛在風(fēng)險(xiǎn)等。所以，如何更好地保證安全性、精準(zhǔn)性并降低成本是目前需要解決的難題。

4.2 作為良好的潛在疫苗

后抗生素時(shí)代面臨的細(xì)菌耐藥使得人類急需開發(fā)更多類型的疫苗。EVs大小適當(dāng)(20～200 nm)，且包含病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)肽聚糖和外膜蛋白(如OmpA蛋白)，它們可以被模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)識別結(jié)合，從而引起免疫反應(yīng)，因此被認(rèn)為是優(yōu)良的候選疫苗[57-58]。目前最成功的例子是關(guān)于腦膜炎球菌OMVs疫苗的研究，研究顯示腦膜炎球菌 OMVs可以刺激人類嗜中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生以及CXCL8，CCL3和CCL4的上調(diào)[59]，于是科學(xué)家利用脫氧膽酸鹽去污劑提取野生型腦膜炎球菌OMVs，此方法提取的OMVs中LPS含量很低，在保證安全的同時(shí)具有良好的免疫原性，已成功用作預(yù)防性疫苗，以預(yù)防腦膜炎球菌疾病的爆發(fā)，古巴、挪威、智利、巴西和新西蘭進(jìn)行多期的臨床實(shí)驗(yàn)表明，在24個(gè)月內(nèi)，對于5歲以下的兒童，疫苗的有效性為80%[60]。另一個(gè)例子是抗百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)的 OMVs疫苗，由滅活的百日咳博德特氏菌菌株165獲得的OMVs中含有幾種免疫原性抗原，包括百日咳毒素，菌毛和百日咳桿菌黏附素，疫苗在小鼠實(shí)驗(yàn)中顯示出良好的保護(hù)作用[61]。還有報(bào)道發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌、炭疽芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌的EVs作為疫苗接種的效果明顯，在小鼠模型中，接種上述細(xì)菌的EVs，再進(jìn)行毒力因子的感染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠存活時(shí)間延長且存活率顯著提升[29，62-63]。鴨源雞桿菌(Gallibacteriumanatis)中的tolR基因敲除突變體能夠過量產(chǎn)生EVs，接種EVs后能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，并提供抗野生型G.anatis菌株感染的保護(hù)作用[64]。

充足的證據(jù)顯示EVs具有成為疫苗的良好潛力，然而細(xì)菌EVs疫苗開發(fā)仍需解決很多難題，包括：①革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的LPS作為內(nèi)毒素具有高致癌性，需要通過各種方法對其去除；②菌株變異形成許多特異性抗原的亞型，從而降低疫苗效果;③細(xì)菌EVs通常分泌量很少且較難分離，成本較高;④細(xì)菌EVs成分豐富，部分成分的功能未知，需要大量的研究進(jìn)行探索?？茖W(xué)家正嘗試通過基因改造細(xì)菌克服以上的難題。已經(jīng)有研究通過基因工程改造無毒的金黃色葡萄球菌突變體可以過量產(chǎn)生無毒的細(xì)胞溶素，含有無毒細(xì)胞溶素的EVs具有免疫原性且無毒，并能夠保護(hù)小鼠免受金黃色葡萄球菌的侵害[65]。當(dāng)然，如何提高細(xì)菌EVs分泌量及降低其潛在危害仍是需要解決的問題。

5 展 望

早在20世紀(jì)60年代就有了關(guān)于細(xì)菌EVs的報(bào)道[66]，研究者在大腸埃希菌培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)了一種囊泡狀小體，被命名為out membrane vesicle(OMVs)。近十年來的深入研究表明，細(xì)菌EVs主要包括基礎(chǔ)研究、功能研究和應(yīng)用研究。細(xì)菌EVs基礎(chǔ)研究包括分泌機(jī)制、分離與純化、表征與檢測和組分分析等；功能研究包括促進(jìn)宿主炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)宿主細(xì)胞死亡、細(xì)菌耐藥性、免疫逃逸等；臨床應(yīng)用包括疾病診斷、小分子藥物的遞送及疫苗研發(fā)等。其功能的多樣性為我們提供了一個(gè)廣闊的應(yīng)用前景，但基礎(chǔ)研究和機(jī)制研究的不完善已成為制約EVs應(yīng)用發(fā)展的屏障，例如：①細(xì)菌EVs形成的機(jī)制對于其醫(yī)學(xué)應(yīng)用至關(guān)重要，但目前仍不清楚，細(xì)菌如何以及為何產(chǎn)生EVs？EVs的形成是自發(fā)的還是受調(diào)控的？如果受到調(diào)控，涉及哪些信號通路？這些研究可以幫助我們解決其產(chǎn)量低和組成復(fù)雜的問題；②細(xì)菌EVs的純度是其應(yīng)用的必要前提，這要求分離純化技術(shù)的改進(jìn)以確保其安全性和穩(wěn)定性；③提取被細(xì)菌感染的宿主細(xì)胞EVs時(shí)，如何證明是細(xì)胞來源還是細(xì)菌來源；④盡管實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OMVs會導(dǎo)致宿主細(xì)胞引發(fā)炎癥，但所涉及到的機(jī)制研究較少，以及機(jī)體的免疫識別受體是否能識別細(xì)菌EVs也缺乏充足的證據(jù)；⑤胞內(nèi)菌和胞外菌具有不同的感染、致病和免疫逃逸機(jī)制，當(dāng)它們感染宿主后，其EVs是否具有不同的作用機(jī)制。尤其目前對于致病菌感染的治療依賴于抗生素，抗生素耐藥性致病菌在臨床接連出現(xiàn)使得EVs的研究更有必要性，相信經(jīng)過不懈的努力細(xì)菌EVs將會為基礎(chǔ)研究和醫(yī)學(xué)發(fā)展提供一個(gè)全新的方向。