養(yǎng)殖塘和市售小龍蝦腸道細(xì)菌多樣性的比較

鄧祥宜, 李池茜, 張涵池, 柯 奧, 鮑曉龍, 李繼偉

(武漢設(shè)計工程學(xué)院 食品與生物科技學(xué)院，湖北 武漢 430205)

腸道微生物與宿主相互依存，參與了維生素合成、物質(zhì)代謝和免疫過程，對動物生長發(fā)育和維持健康具有不可替代的作用[1-4]。宿主種類對腸道細(xì)菌群落組成有重要的選擇作用，進而造就了物種特異性的腸道菌群組成。仔豬腸道細(xì)菌優(yōu)勢門為厚壁菌門(Firmcutes)(49.03%)和擬桿菌門(Bacteroidetes)(31.94%)[5]；驢前腸細(xì)菌優(yōu)勢門為厚壁菌門(92.4%)，后腸為厚壁菌門(55.7%)和擬桿菌門(34.2%)[6]；凡納濱對蝦和羅氏沼蝦腸道微生物種類差異顯著，前者的主要優(yōu)勢門為變形菌門(Proteobacteria)(占75.45%)，而后者的主要優(yōu)勢門為厚壁菌門(占49.74%)[7]。腸道菌群組成還受環(huán)境和飼喂方式的影響[8-9]，養(yǎng)殖環(huán)境對腸道菌群組成影響顯著。蝦蛤混養(yǎng)中，24%的腸道細(xì)菌種類在水體、沉積物中也同時存在，說明腸道微生物群落組成與養(yǎng)殖水體、沉積物密切相關(guān)[2]；不同脂肪源對卵形鯧鲹腸道微生物菌群有顯著影響，豆油組和1∶1魚油-玉米油組中優(yōu)勢菌門為軟壁菌門，其他脂肪源組中優(yōu)勢菌門為變形菌門[10]。此外，有研究表明，健康和患病凡納濱對蝦的腸道菌群組成具有顯著差異[11-13]，腸道菌群組成對宿主的健康狀況具有較強的指示作用[14]。近年來，克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)(又稱小龍蝦)日益走紅，中國已成為世界最大的小龍蝦生產(chǎn)和消費國。根據(jù)中國小龍蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展報告(2019)，2018年小龍蝦產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值達(dá)3 690億元，同比增長37.5%；養(yǎng)殖面積不斷擴大，產(chǎn)量持續(xù)增加，2018年產(chǎn)量增幅為歷年最高，達(dá)45.1%[15]。小龍蝦養(yǎng)殖中，投種的存活率與養(yǎng)殖效益緊密相關(guān)[16]。前期實驗發(fā)現(xiàn)，市售小龍蝦(種蝦、(30±5) g)大多食欲較差，在養(yǎng)殖2周內(nèi)不斷有死亡發(fā)生，最終(60 d養(yǎng)殖周期)存活率為3%～50%，而學(xué)校養(yǎng)殖塘捕撈的小龍蝦(同等大小規(guī)格)攝食較多，在實驗中的存活率接近100%。這種差異也被眾多養(yǎng)殖專家和養(yǎng)殖戶所重視，并在投種時采取就近購買、盡快投放的原則投放蝦苗或種蝦(成蝦)。市售小龍蝦與養(yǎng)殖塘小龍蝦在攝食、存活率上存在顯著差異，腸道菌群與其生長和維持健康密切相關(guān)，但兩者的腸道菌群組成及功能是否存在差異尚不清楚。本研究以武漢設(shè)計工程學(xué)院養(yǎng)殖基地不同養(yǎng)殖塘的小龍蝦和不同市場購買的小龍蝦為材料，通過高通量測序研究其腸道細(xì)菌群落組成，并對優(yōu)勢細(xì)菌類群及群落功能進行比較，以期為評估小龍蝦的健康狀況、分析市售小龍蝦攝食減少、存活率下降的原因和如何提高小龍蝦投種成功率，以及開發(fā)小龍蝦養(yǎng)殖專屬微生態(tài)制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 不同來源的小龍蝦 用地籠從武漢設(shè)計工程學(xué)院養(yǎng)殖基地的兩個不同實驗塘捕獲(用扶龍牌龍蝦飼料投喂，養(yǎng)殖塘2個月內(nèi)未使用任何微生物制劑或其他藥物)，當(dāng)天(2019年9月)取樣，兩個養(yǎng)殖塘樣本分別記為C1、C2；從武漢白沙洲農(nóng)副產(chǎn)品大市場、武漢新竹路市場購買小龍蝦(2019年9月，產(chǎn)地均為湖北)運到實驗室，分別暫養(yǎng)于潔凈大塑料箱中(禁食，室溫)，箱內(nèi)僅加入約1 cm深的去離子水以保持蝦體濕潤，次日取樣(淘汰明顯受傷或活力不強的小龍蝦，選取活動力強的小龍蝦進行實驗)，分別記為市售樣本M1、M2。

1.1.2 主要試劑與儀器 土壤DNA快速提取試劑盒(FastDNA? SPIN Kit for Soil，美國MPbio公司)； DNA 聚合酶(TransStart FastpfuDNA polymerase，北京TransGen生物)； DNA凝膠回收試劑盒(AxyPrep，美國Axygen公司)。PCR儀(GeneAmp?9700，美國ABI公司)；藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(QuantiFluorTM-ST ，美國Promega公司)；高通量測序平臺(Illumina Miseq PE300，美國Illumina 公司)。

1.2 方法

1.2.1 取樣 取不同來源小龍蝦(鮮活、運動狀況良好、(30±5) g/只)各10余只，去附肢后用75%酒精浸泡15 min，無菌水漂洗4次(每次5 min)，并用滅菌的濕棉球?qū)⑽r尾部擦拭干凈，拽拉尾部末端扯出整個腸道，用鑷子將腸道內(nèi)容物擠入滅菌的5 mL離心管中，把同一樣本所有小龍蝦的腸道內(nèi)容物混合，于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取及高通量測序 -80 ℃條件下取出蝦腸道內(nèi)容物，于冰上融化，用土壤DNA快速提取試劑盒提取總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，以NanoDrop 2000 測定DNA純度和含量。以338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3′)為引物，通過PCR擴增16S rDNA V3～V4區(qū)序列。反應(yīng)體系為20 μL：5×FastpfuBuffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、Forward Primer(5 μmol/L)0.8 μL、Reverse Primer(5 μmol/L)0.8 μL、FastpfuPolymerase 0.4 μL、BSA 0.2 μL、Template DNA 10 ng、補超純水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，27個循環(huán)；72 ℃ 10 min；10 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、回收、定量后進行Illumina Miseq測序[17]，測序公司為上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司(上海，中國)。

1.2.3 高通量測序結(jié)果分析 小龍蝦腸道細(xì)菌高通量測序結(jié)果借助美吉生物云平臺進行分析，主要流程：將測序原始序列進行拼接和質(zhì)控，按樣本進行OTU(操作分類單元)聚類分析，OTU分析使用Usearch平臺(version 7.0, http://drive5.com/uparse/)，相似性在97%以上的序列聚為一類；選擇OTU代表序列比對Silva數(shù)據(jù)庫(Release132, http://www.arb-silva.de)進行物種分類學(xué)分析；在OTU水平進行Alpha多樣性分析；基于分類學(xué)信息，在門、科水平上進行群落組成統(tǒng)計分析，在屬水平繪制群落熱圖，根據(jù)物種、樣本間豐度的相似性進行聚類，分析樣本細(xì)菌群落組成相似情況以及主要差異屬；利用PICRUSt軟件包[17-18](version 1.1.0, http://picrust.github.io/picrust/)進行細(xì)菌群落功能分析，使用EggNOG(evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups，http://eggnog. embl.de/)數(shù)據(jù)庫；使用R語言工具、Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本序列統(tǒng)計

小龍蝦腸道細(xì)菌多樣性的測序信息見表1。經(jīng)質(zhì)控、拼接，細(xì)菌16S rDNA序列V3～V4區(qū)共測得176 311條有效序列，平均長度423 bp；去除序列數(shù)小于20的OTU，并按最小序列數(shù)抽平處理[19]，每個樣本獲得抽平后的序列數(shù)為34 912條。

表1 樣本信息和Alpha多樣性指數(shù)

2.2 不同來源小龍蝦腸道細(xì)菌群落Alpha多樣性分析

小龍蝦腸道細(xì)菌群落Alpha多樣性指數(shù)見表1，Sobs、Ace和Chao1指數(shù)可顯示群落物種的豐度，數(shù)值越大代表物種豐度越高；Shannon指數(shù)綜合反映群落多樣性，Shannon指數(shù)越大代表群落多樣性越高；Coverage指數(shù)顯示物種覆蓋度，值越接近1(即100%)表明測序越全面，越能代表樣品真實物種組成情況[20-21]。

表1中，所有樣品測序的覆蓋率(Coverage)指數(shù)均大于99.97%，同時樣品稀釋曲線趨于平緩(圖1)，說明增加測序量只能發(fā)現(xiàn)極少量的物種，即測序結(jié)果能很好地反應(yīng)小龍蝦腸道樣品中的細(xì)菌群落組成。市售樣本(M1、M2)的Sobs、Ace和Chao1指數(shù)高于養(yǎng)殖塘樣本(C1、C2)，顯示市售樣本的物種豐度更高；Shannon指數(shù)顯示M2樣本群落多樣性最高，M1次之，C1、C2多樣性相對較低(表1)。因此，養(yǎng)殖塘小龍蝦腸道細(xì)菌群落豐度和多樣性相對較低，而市售樣本的細(xì)菌群落豐度和多樣性相對較高，這可能與市售小龍蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的細(xì)菌群落有關(guān)，也可能是小龍蝦在運輸和銷售過程中接觸了不同種類的細(xì)菌所致。

2.3 不同來源小龍蝦腸道細(xì)菌群落組成分析

在97%的相似水平上對小龍蝦腸道細(xì)菌16S rDNA V3～V4區(qū)測序結(jié)果進行OTU分析，通過Venn圖展示共有和獨有的OTU數(shù)，結(jié)果見圖 2。經(jīng)前期去除序列數(shù)小于20的OTU和抽平處理，4個樣本共測得130個OTUs，其中C1、C2、M1、M2樣本依次測得69、64、110、95個OTUs；所有樣本共有40個OTUs，遠(yuǎn)高于其他部分共有或獨有OTUs，說明不同來源小龍蝦腸道細(xì)菌種類具有較高的共性。

圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of samples

圖2 OTU水平Venn圖Fig.2 Venn diagram on OTU level

2.3.1 細(xì)菌群落門水平組成 小龍蝦腸道細(xì)菌群落門水平組成見圖3，實驗中共檢出變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、暫定門RsaHF231、軟壁菌門(Tenericutes)、放線菌門(Actinobacteria)等9個門。養(yǎng)殖塘樣本(C1、C2)優(yōu)勢門為變形菌門(占49.98%～58.11%)、厚壁菌門(9.51%～36.76%)、軟壁菌門(6.02%～26.96%)和擬桿菌門(4.06%～4.14%)，暫定門RsaHF231和放線菌門只占1.17%～2.32%、0.15%～0.37%；市售樣本(M1、M2)優(yōu)勢門為擬桿菌門(21.05%～39.22%)、厚壁菌門(20.51%～35.94%)、暫定門RsaHF231(11.55%～46.34%)和變形菌門(占4.29%～11.04%)，軟壁菌門和放線菌門只占0.52%～5.27%、1.69%～1.71%。與養(yǎng)殖塘小龍蝦相比，市售樣本中變形菌門和軟壁菌門相對較少，擬桿菌門和暫定門RsaHF231相對較多，厚壁菌門和放線菌門占比相當(dāng)。

圖3 細(xì)菌門水平相對豐度Fig.3 Relative abundance of bacteria on phylum level

2.3.2 細(xì)菌群落科水平組成 小龍蝦腸道細(xì)菌群落科水平組成見圖3，實驗中共檢出61個科的細(xì)菌。養(yǎng)殖塘樣本(C1、C2)細(xì)菌主要分布在腸桿菌科(Enterobacteriaceae，44.36%～54.37%)、支原體科(Mycoplasmataceae，6.02%～26.96%)、梭菌科(Clostridiaceae，1.95%～33.27%)、擬桿菌科 (Bacteroidaceae，2.28%～2.50%)、希瓦氏菌科(Shewanellaceae，1.25%～3.33%)、暫定門RsaHF231未分類科(1.17%～2.32%)、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae，1.43%～1.85%)、腸球菌科(Enterococcaceae，0%～5.27%)、氣單胞菌科(Aeromonadaceae，0.79%～1.14%)和Family_XⅢ科(0.13%～1.27%)等10個科；市售樣本(M1、M2) 細(xì)菌主要分布在暫定門RsaHF231未分類科(11.55%～46.34%)、擬桿菌科 (Bacteroidaceae，18.23%～28.35%)、梭菌科(Clostridiaceae，0.34%～16.02%)、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae，12.33%～12.36%)、Weeksellaceae科(0.19%～8.83%)、支原體科(Mycoplasmataceae，0.52%～4.81%)、Family_XⅢ科(2.44%～3.17%)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae，0.58%～2.88%)、Dysgonomonadaceae科(1.32%～2.63%)、紅環(huán)菌科(Rhodocyclaceae，1.21%～1.48%)、毛螺菌科(Lachnospiraceae，0.33%～1.87%)和希瓦氏菌科(Shewanellaceae，0.04%～1.69%)等12個科。對比以上數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖塘小龍蝦腸道中腸桿菌科、支原體科細(xì)菌占比遠(yuǎn)高于市售樣本，而市售樣本中暫定門RsaHF231未分類科、擬桿菌科和丹毒絲菌科占比較高。

2.3.3 細(xì)菌群落屬水平組成 小龍蝦腸道細(xì)菌群落屬水平組成見圖5(群落屬水平熱圖)。通過樣品聚類分析發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖塘樣本C1、C2聚為一類，市售樣本M1、M2聚為一類(圖5)，說明C1、C2細(xì)菌群落組成相似(組內(nèi))，M1、M2群落組成相似(組內(nèi))，而養(yǎng)殖塘樣本(C1、C2)與市售樣本(M1、M2)細(xì)菌群落組成差異明顯(組間)。因此，可認(rèn)為養(yǎng)殖塘與市售小龍蝦腸道細(xì)菌群落組成差異明顯。將豐度前50的屬進行聚類分析，找出養(yǎng)殖塘與市售樣本細(xì)菌群落的主要差異屬。市售樣本中豐度相對較高的屬見圖5方框Ⅰ，包括暫定門RsaHF231未分類屬、擬桿菌屬(Bacteroides)、[Anaerorhabdus]_furcosa_group、g_ZOR0006、Weeksellaceae科未分類屬；養(yǎng)殖塘樣本中豐度相對較高的屬見圖5方框Ⅱ，包括檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、哈夫尼菌屬(Hafnia-Obesumbacterium)、支原體科暫定屬(Candidatus_Bacilloplasma)、梭菌科未分類屬、腸桿菌科未分類屬、希萬氏菌屬(Shewanella)和腸球菌屬(Enterococcus)。主要差異屬的豐度及門水平、科水平分類信息見表2。從豐度上看，養(yǎng)殖塘樣本中變形菌門腸桿菌科的檸檬酸桿菌屬和哈夫尼菌屬、軟壁菌門支原體科的Candidatus_Bacilloplasma暫定屬明顯高于市售樣本；市售樣本中暫定門RsaHF231未分類屬、擬桿菌門擬桿菌科的擬桿菌屬、厚壁菌門丹毒絲菌科的[Anaerorhabdus]_furcosa_group和g_ZOR0006明顯高于養(yǎng)殖塘樣本。

圖4 細(xì)菌科水平相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacteria on family level

表2 樣本屬水平的主要豐度差異

圖5 細(xì)菌群落屬水平熱圖(top 50)Fig.5 The bacteria community heatmap on genus level (top 50)

2.4 養(yǎng)殖塘與市售小龍蝦腸道細(xì)菌多樣性差異分析

為了進一步評估各樣本菌群組成差異，基于weighted-unifrac距離算法進行主坐標(biāo)分析(PCoA)，結(jié)果見圖6。第一主成分(PC1)解釋度為75.62%，第二主成分(PC2)解釋度為21.53%；養(yǎng)殖基地不同養(yǎng)殖塘樣本(C1、C2)距離較近，與市售樣本(M1、M2)距離較遠(yuǎn)；市售樣本M1、M2在第一主成分上距離較近，在第二組成分上差異略大。因此，養(yǎng)殖塘與市售小龍蝦的腸道菌群存在明顯差異，這種差異大大超過了不同養(yǎng)殖塘之間或不同市場之間的差異。

2.5 功能預(yù)測分析

通過PICRUSt對16S rDNA測序結(jié)果進行細(xì)菌群落功能預(yù)測，獲得對應(yīng)的COG家族相對豐度，結(jié)果見圖7。除去未知功能分類后，小龍蝦腸道細(xì)菌群落功能中氨基酸轉(zhuǎn)運及代謝、碳水化合物運輸及代謝、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換、無機離子轉(zhuǎn)運和代謝、與復(fù)制/轉(zhuǎn)錄/翻譯/細(xì)胞壁和膜合成相關(guān)功能等豐度較高。不同來源樣本相比，養(yǎng)殖塘樣本COG功能中的能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換、氨基酸轉(zhuǎn)運及代謝、碳水化合物運輸及代謝、無機離子轉(zhuǎn)運和代謝、細(xì)胞運動等明顯高于市售樣本，而市售樣本中核苷酸轉(zhuǎn)運及代謝、與復(fù)制/翻譯/細(xì)胞壁和膜合成相關(guān)功能、防御機制等的相對豐度明顯高于養(yǎng)殖塘樣本。因此，養(yǎng)殖塘小龍蝦腸道細(xì)菌群落的代謝功能旺盛(相對豐度高)；市場樣本代謝功能相對較弱，但與細(xì)菌繁殖、防御的相關(guān)功能較強，即市售樣本細(xì)菌群落抗逆能力更強。

圖6 細(xì)菌物種組成 PCoA 圖(OTU 水平)Fig.6 PCoA diagram of bacterial OTU composition

圖7 PICRUSt推斷的細(xì)菌COG功能相對豐度Fig.7 Relative abundance of inferred bacterial COG functions by PICRUSt A：RNA加工和修飾；B：染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動態(tài)；C：能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換；D：細(xì)胞周期控制、分裂和染色體分配；E：氨基酸轉(zhuǎn)運及代謝；F：核苷酸轉(zhuǎn)運及代謝；G：碳水化合物運輸及代謝；H：輔酶運輸及代謝；I：脂類運輸及代謝；J：翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)及生物合成；K：轉(zhuǎn)錄；L：復(fù)制、重組和修復(fù)；M：細(xì)胞壁/膜生物合成；N：細(xì)胞運動；O：翻譯后修飾、蛋白質(zhì)降解及分子伴侶；P：無機離子轉(zhuǎn)運和代謝；Q：次級代謝物合成、轉(zhuǎn)運及分解；S：未知功能；T：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制；U：細(xì)胞內(nèi)運輸、分泌及囊泡運輸；V：防御機制；W：細(xì)胞外結(jié)構(gòu)；Z：細(xì)胞骨架 A:RNA processing and modification; B:Chromatin structure and dynamics; C:Energy production and conversion; D:Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning; E:Amino acid transport and metabolism; F:Nucleotide transport and metabolism; G:Carbohydrate transport and metabolism; H:Coenzyme transport and metabolism; I:Lipid transport and metabolism; J:Translation, ribosomal structure and biogenesis; K:Transcription; L:Replication, recombination and repair; M:Cell wall/membrane/envelope biogenesis; N:Cell motility; O:Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; P:Inorganic ion transport and metabolism; Q:Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism; S:Function unknown; T:Signal transduction mechanisms; U:Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; V：Defense mechanisms; W:Extracellular structures; Z:Cytoskeleton

3 討 論

本研究通過高通量測序研究了養(yǎng)殖塘和市售小龍蝦腸道菌群多樣性，所有樣本共有OTU數(shù)遠(yuǎn)高于其他部分共有或獨有OTU數(shù)，說明不同樣本細(xì)菌種類有較高的共性；結(jié)合門、科水平群落組成結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，不同樣本的物種豐度存在明顯差異。養(yǎng)殖塘小龍蝦腸道菌群優(yōu)勢門為變形菌門(占49.98%～58.11%)、厚壁菌門(9.51%～36.76%)、軟壁菌門(6.02%～26.96%)和擬桿菌門(4.06%～4.14%)。這與前人研究結(jié)果相似：Guo等[22]發(fā)現(xiàn)變形菌門、軟壁菌門、擬桿菌門、厚壁菌門是小龍蝦腸道細(xì)菌優(yōu)勢門；Zhang等[23-24]發(fā)現(xiàn)小龍蝦腸道細(xì)菌優(yōu)勢門為變形菌門(70.70%～71.59%)、擬桿菌門(18.21%～20.26%)和厚壁菌門(3.01%～6.21%)。變形菌門和厚壁菌門也是羅氏沼蝦腸道的核心菌群，而軟壁菌門含量受環(huán)境影響較大[8]。本研究中，市售小龍蝦腸道細(xì)菌群落主要優(yōu)勢門為擬桿菌門(21.05%～39.22%)、厚壁菌門(20.51%～35.94%)、暫定門RsaHF231(11.55%～46.34%)和變形菌門(4.29%～11.04%)，其中擬桿菌門和暫定門RsaHF231遠(yuǎn)高于養(yǎng)殖塘樣本，而變形菌門(正常核心優(yōu)勢菌門)卻遠(yuǎn)低于養(yǎng)殖塘樣本。

群落熱圖和聚類分析可以展示不同樣本群落組成的相似性以及主要差異種類。Chen等[25]在OTU水平上進行聚類分析，找出了與牙周疾病相關(guān)的口腔微生物類群和口腔正常菌群。本研究通過屬水平群落熱圖、聚類分析和主坐標(biāo)分析(PCoA)發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖塘小龍蝦腸道菌群組成與市售小龍蝦之間的差異大大超過了組內(nèi)差異；檸檬酸桿菌屬和哈夫尼菌屬是養(yǎng)殖塘小龍蝦腸道的正常核心菌群，但其在市售樣本中占比很低；暫定門RsaHF231未分類屬、擬桿菌屬、丹毒絲菌科的[Anaerorhabdus]_furcosa_group和g_ZOR0006等在養(yǎng)殖塘小龍蝦中含量較低，但在市售小龍蝦中占比大幅提升。

在取樣過程中發(fā)現(xiàn)，市售小龍蝦腸道內(nèi)容物遠(yuǎn)少于養(yǎng)殖塘小龍蝦；運輸、銷售和禁食使其處于應(yīng)激狀態(tài)，進而導(dǎo)致腸道細(xì)菌群落發(fā)生了改變；腸道菌群組成的改變也會伴隨群落功能的變化，COG功能預(yù)測結(jié)果顯示養(yǎng)殖塘小龍蝦腸道細(xì)菌群落的代謝功能旺盛，市售樣本的代謝功能相對較弱，但抗逆能力更強，這與禁食后腸道營養(yǎng)匱乏相適應(yīng)。

研究微生物群落組成的方法很多，如分離培養(yǎng)法、Biolog-ECO微平板法[26]、變形梯度凝膠電泳法、16S rRNA/18S rRNA/ITS基因克隆文庫測序法，以及基于16S rRNA/18S rRNA/ITS基因的高通量測序法等[27]。高通量測序法能一次獲得數(shù)萬條菌株序列信息，比其他方法具有更高的靈敏度、準(zhǔn)確度和相對低廉的價格[27]，但其只能揭示樣本微生物群落的相對組成情況即各類別的相對豐度，無法展現(xiàn)絕對豐度。本研究Alpha多樣性分析顯示，市售小龍蝦腸道細(xì)菌豐度和多樣性高于養(yǎng)殖塘小龍蝦，這可能與腸道中正常核心類群(變形菌門的檸檬酸桿菌屬和哈夫尼菌屬)豐度大幅下降造成的其他類群豐度相對增加有關(guān)，這種多樣性的相對增加并不能給小龍蝦帶來益處。養(yǎng)殖塘小龍蝦腸道內(nèi)容物比市售小龍蝦多出數(shù)倍；如果對比細(xì)菌的絕對數(shù)量，市售小龍蝦中變形菌門(正常核心優(yōu)勢菌門)的數(shù)量應(yīng)該比養(yǎng)殖塘低更多，這可能嚴(yán)重影響了小龍蝦的正常生理功能，對其造成了不可逆的影響，甚至影響到存活。

本研究揭示了養(yǎng)殖塘小龍蝦和市售小龍蝦腸道菌群組成的差異，市售小龍蝦中檸檬酸桿菌屬和哈夫尼菌屬等正常腸道核心菌群大幅減少可能與其攝食減少、存活率降低有關(guān)，這可為小龍蝦養(yǎng)殖投種提供參考和理論解釋。同時，在投種中利用微生態(tài)制劑改善小龍蝦腸道菌群，比如在飼料中拌喂小龍蝦腸道中的正常核心菌群(檸檬酸桿菌屬或哈夫尼菌屬)以恢復(fù)蝦腸道細(xì)菌群落組成，或者使用其他益生菌劑來提高蝦的免疫力和存活率，這些都值得進一步研究和探討。