微藻酶的潛在生物技術(shù)應(yīng)用

高保燕，于博涵，張 虎，方云明，張成武

(1. 暨南大學 生命科學技術(shù)學院 生態(tài)學系 水生生物研究中心，廣東 廣州 510632；2.北京化工大學 化工系 生物煉制國家能源研發(fā)中心，北京 100029)

微藻是一類形態(tài)大小各異、能利用太陽能、固定CO2、吸收無機營養(yǎng)鹽轉(zhuǎn)化為有機物的光合低等生物，它們分布于各種生境，如淡水、咸水、海水以及潮濕的土壤或巖石表面，一些嗜極端環(huán)境的微藻可生活于高溫溫泉、雪地、冰川，甚至酸性、堿性或高鹽環(huán)境[1]。微藻種類繁多，估計有十萬多種，而已知微藻的數(shù)量僅占1%，具有巨大的待開發(fā)潛力[2]。其中，許多微藻在適宜的環(huán)境條件下表現(xiàn)出高生長速率和高生物質(zhì)產(chǎn)量，這一特性已被用于生物柴油、生物乙醇、生物制氫和生物沼氣等生物衍生產(chǎn)品的生產(chǎn)[3]。與第一代生物燃料原料相比，盡管微藻的單位面積生產(chǎn)力更高，但如果沒有高價值的副產(chǎn)品，其生產(chǎn)無法實現(xiàn)經(jīng)濟可持續(xù)性。因此，為了提高微藻能源的經(jīng)濟可持續(xù)性，需要在生物煉制方案下提高生物質(zhì)的利用率，最大限度地挖掘生物質(zhì)中的潛在價值。

微藻除了作為生物能源的原料，還可以用來生產(chǎn)高附加值的產(chǎn)品，例如，葉綠素、β-胡蘿卜素、蝦青素、藻藍蛋白和ω-3不飽和脂肪酸等[2]。微藻還有許多潛在商業(yè)應(yīng)用：如在造紙工業(yè)中作為纖維聚合物復合材料和填充材料[4]，化妝品制劑[5]，土壤修復和動物飼料的添加劑[6]以及必需氨基酸，脂質(zhì)(甘油三酯、甘油二酯、磷脂和糖脂)和烯烴[7]等的來源。此外，微藻能有效吸附和回收重金屬、吸收利用廢水中的氮和磷，因此，可用于廢水處理過程[8]。已有許多綜述關(guān)注微藻的高價值產(chǎn)品和生物技術(shù)應(yīng)用[8-9]，但有關(guān)微藻作為重要的潛在工業(yè)酶生產(chǎn)者的研究較少。

酶是催化生物反應(yīng)的有機大分子，即所謂的“生物催化劑”，由于其底物特異性，酶常用于食品加工、制藥和造紙等領(lǐng)域，以改善、擴展和優(yōu)化工業(yè)化生產(chǎn)。目前，細菌和真菌酶(如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等)由于特異性高、副產(chǎn)品少，在食品工業(yè)中得到了大規(guī)模應(yīng)用。全球酶市場產(chǎn)品由少數(shù)微生物酶主導，因此新品種酶的開發(fā)潛力是不可估量的。與其他微生物相比，微藻在工業(yè)酶合成方面具有一些優(yōu)勢，因為微藻通常是光合作用的水生低等生物，生長的營養(yǎng)需求低(天然或人造光、CO2、水和一些無機營養(yǎng)鹽)，可以在光生物反應(yīng)器中進行大規(guī)模培養(yǎng)，因此完全能適合工業(yè)市場領(lǐng)域的需求。因此，本文綜述微藻在不同工業(yè)應(yīng)用中合成酶的巨大能力，具體的酶包括碳酸酐酶、淀粉分解酶、半乳糖水解酶、?；D(zhuǎn)移酶、脂肪酶、脂氧合酶、固氮酶、蛋白酶、腈水解酶、磷酸酶、植酸酶和硫解酶以及一些特殊的微藻源酶類，包括光酶、氫化酶及萜類物質(zhì)合成相關(guān)酶，以期為相關(guān)研究工作提供參考。

1 與碳代謝相關(guān)的酶

1.1 碳酸酐酶

近年來，人們通過碳酸酐酶催化CO2轉(zhuǎn)化為多種有益副產(chǎn)品，包括丙烯酸酯、聚碳酸酯、穩(wěn)定的碳酸鹽聚合物、甲烷或建筑材料[13]。在脊椎動物中，所有的碳酸酐酶都屬于α-CAs，這種酶在萊茵衣藻的細胞質(zhì)中也有發(fā)現(xiàn)，該藻中的碳酸酐酶已被證明與人類的碳酸酐酶具有同源序列，特別是人體中的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型碳酸酐酶(CAⅠ、CAⅡ和CA Ⅲ)[14]。其中，CAⅡ在人類健康方面有重要用途而被廣泛研究。CA Ⅱ可以調(diào)節(jié)冷缺血引起的pH變化，被用作肝保護劑，它還可以改善待移植器官的保存[15]。鑒于微藻和人的碳酸酐酶的同源性及其在醫(yī)學上的用途，微藻源的α-CAs可以作為這些酶的替代來源。因此，CAs可用作保護移植器官的酶，它有非常好的應(yīng)用前景。

1.2 淀粉分解酶

淀粉酶(amylase)可以促進淀粉水解為低聚糖和多糖。最著名的淀粉酶有α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)、異淀粉酶(EC 3.2.1.68)和α-糖苷酶(EC 3.2.1.20)[16]。Levis等[17]發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻在光自養(yǎng)培養(yǎng)條件下，光/暗周期為12 h/12 h循環(huán)時，整個細胞周期淀粉酶的活性都很高，但在黑暗條件下，4 h后其活性最強。Shang等[18]研究杜氏藻屬(Dunaliella)中淀粉分解代謝酶的編碼基因時，鑒定出了兩種不同的代謝途徑，一條水解途徑和一條磷酸化途徑。在德氏杜氏藻(Dunaliellatertiolecta)中，與水解代謝相關(guān)的酶是α-淀粉酶和寡聚-1,6-葡萄糖苷酶；在小杜氏藻(Dunaliellaparva)中鑒定出了α-淀粉酶和β-淀粉酶。這3種酶負責淀粉的水解產(chǎn)生葡萄糖。而在淀粉的磷酸化分解過程中，小杜氏藻中為糖原磷酸化酶，德氏杜氏藻中為淀粉磷酸化酶。

1.3 α-D-半乳糖苷水解酶

α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(α-Gal，EC 3.2.1.22),也稱α-半乳糖苷酶，可水解寡糖和半乳聚多糖中α-1，6-鍵連接的半乳糖殘基，釋放出α-D-半乳糖。半乳糖苷酶在紙漿、糖、食品和動物飼料工業(yè)中具有應(yīng)用價值。

Brasil等[16]在一種吞噬混養(yǎng)型金藻——馬勒海姆尾棕鞭藻(Poterioochromonasmalhamensis)中檢測到了細胞內(nèi)α-半乳糖苷酶(α-Gal)活性，這是一種具有滲透調(diào)節(jié)機制的單細胞金褐藻類；在pH 7.0時，α-半乳糖苷酶在馬勒海姆杯棕鞭藻提取物中表現(xiàn)出最高活性；在較高的外部滲透壓條件下，細胞在幾分鐘內(nèi)收縮，細胞合成胞內(nèi)異弗羅里多苷(isofloridoside)(α-半乳糖甘油)，這會誘導細胞內(nèi)的α-半乳糖苷酶的產(chǎn)生，從而分解細胞內(nèi)的異弗羅里多苷，釋放出甘油和半乳糖；同時，釋放出來的甘油或半乳糖中的一部分又被轉(zhuǎn)化成葡聚糖儲存在藻細胞中，或者作為細胞壁成分。由此可見，半乳糖和甘油作為滲透調(diào)節(jié)機制的產(chǎn)物在細胞內(nèi)積累，維持重要的細胞活動。

Davies等[19]檢測微藻的半乳糖苷酶活性時發(fā)現(xiàn)，在9種綠藻和藍藻中，有8種表現(xiàn)出β-D-半乳糖苷酶活性，其中鼓藻(Cosmariumsp.)和斜生尖帶藻(Acutodesmusobliquus)具有較高的酶活性。Girard等[20]在研究干酪乳清滲透液作為斜生尖帶藻混養(yǎng)培養(yǎng)基的部分替代品時發(fā)現(xiàn)，乳糖可被該藻吸收利用，從而使培養(yǎng)基中乳糖濃度降低和胞內(nèi)葡萄糖、半乳糖積累，以此推斷該藻在細胞外產(chǎn)生了β-半乳糖酶。

Sanada等[21]使用乳清和其他工農(nóng)業(yè)廢料作為底物，從酵母、霉菌和細菌中生產(chǎn)α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶，這些產(chǎn)品也可能是微藻合成半乳糖苷酶的潛在誘導劑。α-半乳糖苷酶誘導劑包括D-半乳糖、蜜二糖(melibiose)、水蘇糖和棉籽糖，β-半乳糖苷酶誘導劑是乳糖。未來的研究需要重點分析α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶在微藻代謝中的作用。

1.4 二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶

微藻能積累大量的脂質(zhì)，其中關(guān)于甘油三酯(TAGs)和多不飽和脂肪酸(PUFAs)的研究是最多的，特別是它們應(yīng)用于生物柴油和營養(yǎng)食品[22]方面的研究。TAGs是由甘油和脂肪酸(FA)衍生而來的酯類，它們通常儲存在細胞質(zhì)的脂滴中，可通過酸或堿催化的酯交換反應(yīng)生產(chǎn)生物柴油。就PUFAs而言，其有益健康的功效已得到充分證明，尤其是ω-3多不飽和脂肪酸，如二十碳五烯酸(EPA) 和二十二碳六烯酸(DHA)[23]。

脂質(zhì)合成過程中最受關(guān)注的酶是二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT, EC 2.3.1.20)，它催化TAG生物合成途徑的最后一步反應(yīng)，該酶有3個獨立的酶組分，分別為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型的二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGATⅠ、DGATⅡ、DGATⅢ)。Guo等[24]在橢圓小球藻(Chlorellaellipsoidea)中發(fā)現(xiàn)了編碼DGATⅠ的基因，隨后在產(chǎn)油微藻海洋微擬球藻(Nannochloropsisoceanica)中進行了DGATⅠ過表達的研究[25]，最初的DGATⅡ序列是從單細胞綠藻——金牛鴕球藻(Ostreococcustauri)獲得的，并進行了DGATⅡ過表達研究[11]。DGATⅡ的過表達促進硅藻——三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)和假小海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)以及富油新綠藻(Neochlorisoleoabundans)和海洋微擬球藻(N.oceanica)中TAG產(chǎn)量的增加[22]。不同的DGAT Ⅱ同工酶(NoDGAT ⅡA、ⅡC、ⅡD)已被鑒定出來，Xin等[26]分析了其基因在過表達或低表達的不同組合時油脂的響應(yīng)情況，這些組合可產(chǎn)生不同的脂肪酸組成，其中一些可針對脂肪酸營養(yǎng)需求進行優(yōu)化，而其他則可針對生物燃料進行優(yōu)化。在萊茵衣藻中過表達不同DGAT Ⅱ的亞型后，有的可以顯著提高TAG含量，有的對TAG的含量沒有顯著影響[22]。最近，Cui等[27]在三角褐指藻中鑒定了一種雙功能蠟酯合酶(WS)/ DGAT酶，將其過表達可同時提高TAG和蠟酯的積累量。

除DGAT以外，還可以過表達其他基因以提高高價值脂質(zhì)產(chǎn)量，包括葡萄糖6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)、Δ6-去飽和酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGD)、甘油3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT1-GPAT2)和乙酰輔酶A合成酶2(ACS2)的基因，這些酶的基因過表達可提高脂質(zhì)含量[22]。

1.5 脂肪酶

脂肪酶(lipase, EC 3.1.1.3) ，又稱三酰基甘油?；饷?，是天然水解甘油三酯生成脂肪酸和甘油的酶。然而，在水受限的環(huán)境中，它們可以催化酯化、酯交換、酯間酯化和氨解反應(yīng)[16]，廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品、香料、醫(yī)藥、化工、農(nóng)藥和化妝品行業(yè)中，所以脂肪酶是生物技術(shù)應(yīng)用中最重要的酶之一。

與細菌、真菌、動物和植物的脂肪酶相比，微藻的脂肪酶及其編碼基因研究較少。Demir等[28]最先從鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)中分離并鑒定了一種脂肪酶，該脂肪酶經(jīng)純化后，比酶活為45 U/mg，該酶蛋白具有單體性和對酯鍵3位的特異性。Godet等[29]從球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)中鑒定出一個新的基因，該基因編碼457個氨基酸，分子量為4.9×104脂肪酶，并研究發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)與已知的脂肪酶相似，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示與真菌脂肪酶序列同源。

近十年來，研究綠藻脂質(zhì)代謝的模式微藻主要是萊茵衣藻，它的基因組中存在許多編碼脂肪酶的基因。與許多其他微藻一樣，萊茵衣藻在氮缺乏的情況下會積累三酰甘油(TAG)，這種情況會導致全基因組的轉(zhuǎn)錄本改變，在缺氮調(diào)控的基因中，有許多編碼脂肪酶的基因[30]。Li等[31]鑒定了萊茵衣藻的一株突變體，當微藻在氮缺乏時，半乳糖-甘油脂酶的編碼基因表達上調(diào)，如果破壞半乳糖-甘油脂酶編碼基因則會導致TAG含量的降低和半乳糖-甘油脂的水解。Mansfeldt等[32]也證實，在氮缺乏條件下小球藻(Chlorellasp.)的半乳糖-甘油脂酶的基因表達上調(diào)。在萊茵衣藻中，與TAG水解有關(guān)的脂肪酶基因在氮缺乏時表達下調(diào)[31]，Li等[31]鑒定出了該脂酶編碼基因CrLIP1，并發(fā)現(xiàn)：在TAG積累過程中，編碼水解TAG、DAG (二酰甘油)或MAG (單酰甘油)的脂肪酶基因的表達被抑制；當再次補氮時，CrLIP1轉(zhuǎn)錄本數(shù)量減少，TAG水解有所延遲，這證實了CrLIP1參與了衣藻TAG脂解，CrLIP1編碼的脂肪酶可以水解由TAG脂解生成的DAG，促進TAG的轉(zhuǎn)換。

Yong等[33]從蘇德臺葡萄藻(Botryococcussudeticus)中制備、純化并鑒定了一種胞外脂肪酶，對其研究發(fā)現(xiàn)：在人工光源續(xù)光照以及室溫條件下，添加橄欖油并進行攪拌是其生產(chǎn)脂肪酶的最佳條件；純化后的脂肪酶分子量為1.2×105，在50 ℃、pH為10時，具有最大活性,該脂肪酶還具有良好的熱穩(wěn)定性，應(yīng)用潛力巨大。

1.6 脂氧合酶

脂氧合酶(LOXs,EC 1.13.11.12)是專一催化含有1，4 -順式戊二烯體系的不飽和脂肪酸雙加氧生成順式、反式共軛的單氫過氧化物的酶。當亞油酸作底物時，這些酶催化產(chǎn)生脂氧素13-氫化氧-9，11-十八烯二烯酸(13-HPODE)和9-氫化氧-10，12-十八烯二烯酸(9-HPODE)[34]。許多脂氧素(oxylipins)途徑的產(chǎn)物都參與植物防御機制，如由植物產(chǎn)生的茉莉酸酯和揮發(fā)性化合物(主要是十八烷類和十六烷類)，可激活其對昆蟲和病原體的防御機制[34]。此外，亞油酸的羥基衍生物表現(xiàn)出抗菌性能[3]。

脂氧合酶(LOXs)是脂氧素途徑的起始酶和關(guān)鍵酶，雖然這些酶存在于不同的生物體中，但是它們是多系起源的[35]。海產(chǎn)紅藻——壇紫菜(Pyropiahaitanensis)中的脂氧合酶具有多個催化位點，Chen等[35]分析了它們的不同反應(yīng)產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)該酶是一種多功能酶，具有脂氧合酶、過氧化物裂解酶(HPL)和氧化丙二烯合酶(AOS)活性。多功能的LOXs在自然界是非常稀缺的，但在海洋藻類中包含以20碳多不飽和脂肪酸為底物的5R、8R、9S、12S和15S脂氧合酶，以及催化十八碳的ω3、ω6、ω9和ω10脂氧合酶[3]。因此，紅藻和硅藻的脂氧素代謝具有動物(二十烷類)和植物(十八烷類)脂氧素的雙重特征，可參與免疫調(diào)節(jié)。這種在紅藻中既可以產(chǎn)生動物型脂氧素，又可以產(chǎn)生植物型脂氧素的代謝，是由高度多樣性的LOXs所催化的，由此藻類被認為是脂氧素多樣性最豐富的生物[3]。

許多藻類的LOXs是非特異性，可以催化不同的多不飽和脂肪酸。如壇紫菜中的LOXs以C18～C22為底物，催化γ-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸產(chǎn)生不同的脂氧素[35]。該藻僅用一種脂氧合酶(PhLOX2)可催化4種多不飽和酸得到16種不同的脂氧素產(chǎn)品。脂氧素參與藻類的生物防御機制，如網(wǎng)翼藻(Dictyopterissp.)可抵御食草片腳類動物(herbivorous amphipods)[36]，而硅藻細胞內(nèi)的醛脂氧素對細菌、真菌甚至無脊椎動物具有毒性[37]。由此可見，使用藻類的LOXs生產(chǎn)/誘導脂氧素是研究生物防治一個巨大的機會。

1.7 硫解酶

硫解酶(thiolase)是一種分布廣泛的酶，它存在于原核生物和真核生物中。這個酶家族可以進一步細分為分解代謝型硫解酶(EC 2.3.1.16)和合成代謝型硫解酶(EC 2.3.1.9)，兩者都能催化2個乙酰輔酶A分子縮合生成乙酰乙酰輔酶A。硫解酶是延伸碳骨架的關(guān)鍵酶，從代謝前體乙酰輔酶A開始合成其他化合物。合成型的硫解酶僅能利用乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A作為底物。然而，分解代謝型的硫解酶可針對不同的底物，包括參與脂質(zhì)代謝的分子量較大的底物(如3-酮癸酰輔酶A)。

硫解酶存在于微藻的不同細胞器中：在轉(zhuǎn)板藻(Mougeotiasp.)中，硫解酶和?；o酶A氧化酶只存在于過氧化物酶體中；而在擬桿藻(Bumilleriopsissp.)中，所有脂肪酸氟氧化途徑的酶(包括巰基酶)都在線粒體中[38]；在纖細裸藻(EuglenagracilisKlebs)和獨球藻(Eremosphaerasp.)中，在過氧化物酶體和線粒體中，都發(fā)現(xiàn)了硫醇化酶和?；o酶A氧化酶[38]。人們對硫解酶的興趣越來越大，因為它們是甲羥酸途徑中合成幾種甾醇(例如麥角甾醇)的關(guān)鍵酶。麥角甾醇是真菌和藻類的主要甾醇，它是由乙酰輔酶A產(chǎn)生的，被證明具有抑制癌癥和腫瘤生長的作用[39]。為了獲得較高的麥角甾醇產(chǎn)量，已有一些關(guān)于提高硫解酶活性的研究，然而，僅僅提高硫解酶活性并不足以在酵母中獲得高水平的甾醇。在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，麥角甾醇含量高時，乙酰輔酶A硫解酶的活性受到抑制，而麥角甾醇含量低時，其活性增加[40]。乙酰輔酶A硫解酶(thiolaseⅡ)通過甲羥酸調(diào)節(jié)異戊二烯的生成，它是藍盒藻(Cyanophorasp.)、加爾迪藻(Galdieria)、花青藻(Cyanidium)、中眼藻(Mesostigma)和裸藻(Euglena)等生物合成類胡蘿卜素的關(guān)鍵酶，但綠藻已經(jīng)失去了這一代謝途徑[41]。

藻類中異戊二烯類化合物的代謝工程引起了人們的關(guān)注，主要是因為它們在工業(yè)上的應(yīng)用價值極大。通過硫解酶Ⅱ和3-酮脂酰硫解酶3-ketothiolase可以獲得乙酰乙酰輔酶A，以此來生產(chǎn)聚羥基丁酸酯(PHB)，它是生物可降解塑料的重要前體，還可以用來生產(chǎn)丁醇。因此，藻中的硫解酶是甾醇和異戊二烯生物合成的關(guān)鍵酶，在酶促級聯(lián)的策略下，可以用于生物塑料和生物燃料的制造。

2 與氮代謝有關(guān)的酶

2.1 固氮酶

固氮酶(nitrogenase)是生物固氮的關(guān)鍵酶，藍藻是生態(tài)系統(tǒng)中完成這一重要功能的主要生物體。固氮酶是一種酶的復合物，由二硝基酶(Mo-Fe蛋白, EC 1.18.6.1)和二硝基還原酶(Fe蛋白, EC 1.19.6.1)組成。二硝基酶鉬鐵蛋白是一種四聚體，其亞基由nifD和nifK基因編碼，二硝基還原酶鐵蛋白有2個相同亞基的二聚體，由nifH基因編碼[3]。鐵蛋白從外部供體(鐵氧蛋白或黃素蛋白)收集電子，并通過ATP依賴的過程將電子轉(zhuǎn)移到鉬鐵蛋白，鉬鐵蛋白利用還原能力將N2轉(zhuǎn)化為銨。

藍藻的固氮作用在許多自然和人工生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的生態(tài)意義。例如，每年稻田中的藍藻固氮量為5 g/m2，而極地地區(qū)淺湖中的藍藻固氮極其重要，每年達1.5 g/m2。在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，一些藍藻，如束毛藻(Trichodesmiumsp.)和胞內(nèi)植生藻(Richeliaintracellularis)(與硅藻結(jié)合)是主要的固氮成員，固氮量可與硝酸鹽輸入量相當[43]。在全球范圍內(nèi)，海洋固氮量估計與陸地固氮量相近((1～2)×108t/a)，束毛藻(Trichodesmium)固定(6～8)×108t/a的氮。藍藻巨大的固氮能力對生態(tài)系統(tǒng)和人類活動非常有價值，比如水稻生產(chǎn)時，固氮藍藻在其生產(chǎn)周期內(nèi)固氮量可達70～110 kg/ha。

2.2 蛋白酶

蛋白酶(protease)是一大類催化蛋白質(zhì)和肽分子的肽鍵裂解的酶，廣泛應(yīng)用于洗滌劑、制藥和食品工業(yè)。在微藻代謝過程中，蛋白酶活性在光照或營養(yǎng)鹽受限制等脅迫條件和細胞凋亡時反而增加，藍藻中的蛋白酶在控制細胞器衰老和異形胞形成中也發(fā)揮作用[15]。

Lockau等[44]研究了一種來自藍藻——多變魚腥藻(Anabaenavariabilis)鈣依賴性的絲氨酸蛋白酶，該酶是一種類似胰酶的蛋白酶，需要鈣才能充分發(fā)揮活性。Strohmeier等[45]研究缺乏這種鈣依賴性蛋白酶的多變魚腥藻突變體IM 141時發(fā)現(xiàn)，多變魚腥藻中含有第二種可溶性類似胰蛋白酶的蛋白酶，即脯氨肽酶(prolylendopeptidase)。Niven[46]利用多變魚腥藻首次純化了氨肽酶，用凝膠過濾色譜法分離出2種不同分子量大小的酶(1.88×105和5.9×104)，并研究了它們對不同的底物特異性，較大的酶對二肽和三肽具有特異性，而較小的酶能夠水解較長的寡肽。Nanni等[47]從鈍頂節(jié)旋藻中分離純化了一種新型的絲氨酸蛋白酶，并對其進行了部分表征。Yada等[48]從鈍頂節(jié)旋藻中純化了一種新的精氨酸特異性蛋白酶(Sp-蛋白酶)，該酶可以水解明膠和纖維蛋白，但不能夠水解藻藍蛋白。這2種酶的分子量均為8.0×104，且不依賴于Ca2+。由此可知，微藻具有產(chǎn)蛋白酶的能力，且蛋白酶的產(chǎn)生與氮源的濃度和類型有關(guān)[49]，因此未來的研究應(yīng)著重評估培養(yǎng)基中氮源的變化對微藻產(chǎn)蛋白酶及其活性的影響。

2.3 腈水解酶

腈水解酶(nitrilase,EC 3.5.5.1)是一種用途廣泛的腈代謝酶，可取代強酸或堿催化劑而對腈進行水解反應(yīng)。腈是氰基取代的羧酸，一般結(jié)構(gòu)為R-CN，這些化合物被大規(guī)模合成，用作塑料工業(yè)、合成橡膠以及制藥、除草劑和其他重要化學品工業(yè)的原材料[3]。此外，大多數(shù)腈類具有高毒性，利用生化法來降解它們是工業(yè)水體污染處理和土壤解毒的有效方法[50]。

在植物中，腈水解酶參與氰化物和氰化糖苷的分解代謝，可能還參與硫代葡萄糖苷的分解代謝。氰化物是植物激素乙烯生物合成過程中的代謝副產(chǎn)品，而腈水解酶可將中間產(chǎn)物β-氰丙氨酸轉(zhuǎn)化為天冬酰胺、天冬氨酸和氨，在許多微藻中發(fā)現(xiàn)了腈水解酶，并以吲哚-3-乙腈為底物合成吲哚-3-乙酸，微藻腈水解酶的活性位點有1個半胱氨酸殘基，當其巰基未質(zhì)子化時，半胱氨酸殘基可作為親核試劑催化底物[51]。盡管利用微藻進行氰化物分解的研究較少，但是微藻源的腈水解酶還是有望應(yīng)用于分解氰化物。Gurbuz等[52]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)具有將氰化物轉(zhuǎn)化為β-氰丙氨酸和γ-谷氨酰-β-氰丙氨酸的能力，并將其作為碳源和氮源，進行再次利用。此外，微藻生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)比一些細菌和真菌少，而一些微藻如斜生四鏈藻(Tetradesmusobliquus)能在68 h內(nèi)分解400 mg/L的氰化物[52]，采礦廢水中通常含有大量氰化物，因此可以用斜生四鏈藻去除氰化物作為一種可行的礦物廢水生物處理工藝。含有腈水解酶或游離腈水解酶的藻類可能是生物修復過程的一個很好的選擇，然而，需要更多有關(guān)提高藻類腈水解酶含量和活性的研究結(jié)果來支持這一觀點。

3 與磷代謝有關(guān)的酶

3.1 磷酸酶

磷酸酶(phosphatases)是一類催化有機物釋放無機磷的酶，基于此，植物、藻類和真菌等都能利用磷。由于海水的pH為堿性(8.3)，所以在海藻中主要產(chǎn)生的是堿性磷酸酶(AP, EC 3.1.3.1)，但是這些磷酸酶在細胞內(nèi)不是以游離狀態(tài)存在，它們主要存在于藻類細胞的細胞壁、外膜或細胞質(zhì)周間隙中。AP對磷的濃度非常敏感，因此有利用石花菜屬(Gelidium)、剛毛藻屬(Cladophora)、多管藻屬(Polysiphonia)和蝦夷杉藻屬(Stypocaulon)藻細胞內(nèi)AP活性變化來進行環(huán)境監(jiān)測的研究[53]。單細胞藻類如普通鏈帶藻(Desmodesmuscommunis)和臺灣星桿藻(Asterionellaformosa)的磷酸酶活性變化可用作胞內(nèi)磷狀態(tài)的指示物[54]：一般來說，當磷的利用率較高時，磷酸酶活性較低，反之亦然。然而，磷酸酶活性的增加或減少，主要取決于磷的濃度。

因為AP對重金屬污染的敏感性，所以磷酸酶可用于水質(zhì)監(jiān)測。小球藻的AP已被用作重金屬(Cd2+和Zn2+)廢水的生物傳感器，這對持續(xù)監(jiān)測水體具有重要意義，當四尾柵藻和鉤背隱桿藻(Aphanothecenidulans)暴露于Ni2+、Zn2+和Cd2+時，AP活性下降，而鈍頂節(jié)旋藻暴露于Cd2+和Hg2+時AP活性下降[55]。同時，藻細胞可以被固定化后重復利用，這為簡單快速檢測水體中的重金屬污染提供了可能。

一些藻類的磷酸酶具有重要的生物學作用。甘露醇是一種多聚醇，在藻類中用作滲透保護劑，在醫(yī)學和工業(yè)上有許多應(yīng)用。它可以作為一種神經(jīng)保護化合物用于帕金森治療，并在多種手術(shù)中控制顱內(nèi)壓升高和保護腎臟[56]。甘露醇是褐藻中儲藏型碳水化合物的主要成分之一，可占其干質(zhì)量的20%～30%，該多元醇通過兩個酶促反應(yīng)生成。首先，甘露醇-1-磷酸脫氫酶將果糖-6-磷酸還原為甘露醇-1-磷酸，隨后甘露醇-1-磷酸磷酸酶將甘露醇中的磷酸基團釋放出來，生成甘露醇。Groisillier等[57]鑒定了長囊水云(Ectocarpussilicolosus)的甘露醇磷酸酶基因(EsM1Pase1和EsM1Pase2)，與鷓鴣菜(Caloglossacontinua)和微胞藻(Micromonassp.)的甘露醇磷酸酶進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，褐藻的甘露醇磷酸酶的序列和其直系同源基因代表一個新的磷酸酶家族，在鹵酸(haloacid)脫氫酶超家族中具有新的底物特異性，可以將這些基因克隆到細菌中進行異源表達以獲取酶。因此，利用特異性的藻類磷酸酶催化生產(chǎn)甘露醇可作為一種從果糖中提取甘露醇的替代方法。

因此，藻類磷酸酶不僅在水體磷循環(huán)中具有重要的生態(tài)意義，而且已被成功地用作磷有效性和重金屬生物傳感器，在生物監(jiān)測領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值，并且藻類磷酸酶可以進一步應(yīng)用到其他領(lǐng)域，如用于生產(chǎn)甘露醇。

3.2 植酸酶

植酸酶(phytases) ，又稱肌醇六磷酸酶，能夠水解去除植酸中的磷酸殘基，而植酸是谷物和植物種子中有機磷(P)儲存的主要分子。植酸酶可以添加到動物飼料中以提高磷的生物利用度，同時植酸酶在食品加工中具有潛在應(yīng)用價值[16]。根據(jù)植酸脫磷酸化起始位置，植酸酶可分為以下3種類型: 3-植酸酶(EC 3.1.3.8)、6-植酸酶(EC 3.1.3.26)和5-植酸酶(EC 3.1.3.72)。

Klanbut等[58]從泰國分離了4種耐熱藍藻：青灰聚球藻SKP50(Synechococcuslividus)、青灰聚球藻DSK74(Synechococcuslividus)、雙粒聚球藻(Synechococcusbigranulatus)和嗜熱擬色球藻(Chroococcidiopsisthermalis)，從這4種藍藻中都檢測到了植酸酶活性，青灰聚球藻SKP50的植酸酶最大活性為1.83 mU/mL。雖然細胞外培養(yǎng)液中植酸酶活性不高，但可以進一步研究來確定微藻是否能夠產(chǎn)生植酸酶以及該酶是否為胞外酶。此外，可以在未來的研究中優(yōu)化培養(yǎng)基成分，即用特定底物(如有機磷源)來誘導合成植酸酶。

4 氫化酶

氫化酶(H2ases, EC 1.12.1.12)是催化分子氫氧化或者質(zhì)子還原這一可逆過程的酶。它們在微生物代謝中發(fā)揮著核心作用，是光合生物產(chǎn)生H2的重要酶。根據(jù)氫化酶的活性中心所含金屬不同，氫化酶可分為三類：[Fe]-H2ases、[NiFe]-H2ases和無金屬H2ases[59]。這些酶可用于生物制取H2，比現(xiàn)有的物理化學制氫方法在環(huán)境保護方面有明顯的優(yōu)勢。生物光解產(chǎn)氫是指利用微生物，通常是微藻和/或藍藻，通過光合反應(yīng)將水和太陽能轉(zhuǎn)化為H2和O2[59-60]。微藻產(chǎn)生H2的基礎(chǔ)是光系統(tǒng)1(PS1)被激活而產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移，電子先流向鐵氧化還原酶，再流向氫化酶，整個過程都在類囊體結(jié)構(gòu)中發(fā)生。在綠藻的葉綠體中，鐵氧蛋白作為[Fe]-H2ase的電子供體。

現(xiàn)在研究生物制氫的主要藻類是衣藻，也有以螺旋藻和魚腥藻[60]為研究對象生物制氫的研究。此外，普通小球藻(Chlorellavulgaris)和奧古斯塔衣藻(Chlamydomonasaugusta)也具有轉(zhuǎn)化光能制氫的能力。由于藻類制氫的產(chǎn)量非常低，如果想要達到商業(yè)生產(chǎn)的水平，就需要更多的研究來達成這一目標。

5 微藻源光酶

光酶(photoenzyme)是催化光化學反應(yīng)的酶類，它們的催化活性由光驅(qū)動，而且需要持續(xù)光照才能一直起作用[61-62]。自然界中光酶的存在類型較少，目前主要有3個家族的蛋白擁有光催化活性，即光修復酶(photolyase,EC 4.1.99.3)、光依賴型NADPH:原葉綠素酸酯氧化還原酶(LPOR, EC 1.3.1.33)以及脂肪酸光脫羧酶(FAP, EC 4.1.1.106)。

紫外光(UV)輻射可導致同一條DNA鏈上兩個臨近的胸腺嘧啶共價結(jié)合形成環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPD)或6-4嘧啶-嘧啶酮光產(chǎn)物(6-4PPs)，阻礙DNA的正確復制和轉(zhuǎn)錄，不利于細胞的生命活動，甚至引起細胞死亡[63]。光修復酶是在可見光下能夠修復紫外損傷產(chǎn)物CPD和6-4PPs的這類黃素蛋白，根據(jù)修復底物的不同，分為CPD光修復酶和6-4PPs光修復酶[64]。光修復酶修復損傷DNA的基本過程是先識別底物，然后進行特異性的結(jié)合，在近紫外-藍光(300～500 nm)照射下，一個電子從被激發(fā)的黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH-)轉(zhuǎn)移給DNA底物，得到電子的底物裂解成一個嘧啶單體和一個嘧啶單體陰離子自由基，后者將多余的電子返還給中性狀態(tài)的FADH·，恢復兩個嘧啶單體和具有催化活性的FADH-；最后，光修復酶從修復的DNA上解離下來，完成DNA光修復過程。

隨著對光修復酶的深入研究，研究者們發(fā)現(xiàn)光修復酶和隱花色素的序列高度同源，他們將光修復酶和隱花色素共同歸屬于隱花色素/光修復酶家族(cryptochrome/photolyase family，CPF)[65]。在對藻類CPF的研究中發(fā)現(xiàn)隱花色素/光修復酶的功能并沒有完全分開。例如：三角褐指藻中的PtCPF1既能夠修復6-4PPs，又可以調(diào)控藍光受體[66]；金牛鴕球藻(Ostreococcustauri)中的OtCPF1可以修復6-4PPs，調(diào)控生物鐘；萊茵衣藻中的aCRY能夠修復6-4PPs，同時調(diào)控藍光受體和紅光受體。這些結(jié)果說明藻類中的光修復酶仍保留了一些相對原始的功能，對于研究自然界中光修復酶的進化機制具有重要意義。

圖1 輔酶NADPH存在時，NADPH:原葉綠素氧化還原酶在光驅(qū)動下將原葉綠素酸酯還原為葉綠素酸酯[67]Fig.1 Light-induced reduction of protochlorophyllide to chlorophyllide catalyzed by the enzyme NADPH:protochlorophyllide oxidoreductase in the presence of NADPH as cofactor[67]

脂肪酸光脫羧酶(FAP)是近些年才在多變小球藻(C.variabilisNC64A)和萊茵衣藻中發(fā)現(xiàn)的一種光酶，它以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔酶，在藍光下可將脂肪酸轉(zhuǎn)化為烴類化合物，其作用機制是將FAD的生物催化性質(zhì)和光受體性質(zhì)結(jié)合在一起，通過自由基化學催化脂肪酸，移除脂肪酸中的羧基，從而形成烴類化合物[62]，具體催化過程如圖2所示，這個過程既可以通過一步催化(紅色框)，也可以通過三步催化(藍色框)，從而將脂肪酸轉(zhuǎn)化為烷烴類化合物[61]。這種光酶的發(fā)現(xiàn)對于從藻類中生產(chǎn)烷烴類燃料提供了新方法，同時也為利用光酶高效清潔制備燃料提供了新思路。

圖2 脂肪酸光脫羧酶催化脂肪酸轉(zhuǎn)化為烴類化合物[61]Fig.2 Hydrocarbons from fatty acid by photodecarboxylase [61]

6 與萜類物質(zhì)合成有關(guān)的酶

萜類化合物或異戊二烯類衍生物(terpenoid/isoprenoid)是一類具有較強結(jié)構(gòu)多樣性、顯著生物活性的碳氫化合物，其骨架多樣性主要歸因于萜烯合成酶類(terpene synthases)[70]。陸生植物和藻類能產(chǎn)生大量萜類化合物，通常是通過甲羥戊酸(MVA)途徑或非甲羥戊酸(MEP/DOXP)途徑實現(xiàn)。MVA途徑以乙酰輔酶A為原料，合成異戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)；而MEP途徑是以丙酮酸和3-磷酸甘油醛為原料，2-甲基赤蘚醇磷酸(MEP)為中間產(chǎn)物，達到合成IPP和DMAPP的目的。IPP和DMAPP在焦磷酸鹽合成酶(pyrophosphate synthases)的作用下可以縮合成高階的碳骨架，即不同種類的焦磷酸(分別為GPP、FPP和GGPPS)，這些是構(gòu)成由萜烯合成酶活性介導的類異戊二烯產(chǎn)物的基礎(chǔ)[71]。單萜合成酶(mTPS)催化GPP生成C10單萜化合物，倍半萜合成酶(sTPS)催化FPP生成C15倍半萜化合物，三萜合成酶(tTPS)催化C30角鯊烯生成三萜化合物(角鯊烯是由2個FPP分子通過角鯊烯合成酶生成的)，二萜合成酶(diTPS)催化C20 GGPP生成二萜類化合物 (圖3)[72]。

圖3 萜類化合物次級代謝[72]Fig.3 Terpenoid secondary metabolism[72]

目前已知兩種類型的萜烯合成酶：典型的植物萜烯合成酶和微生物類萜烯合酶(MTPSL)，其中MTPSL基因是近年才被發(fā)現(xiàn)的，可能只出現(xiàn)在非種子植物中[73]。Kersten等[74]從大型紅藻——太平洋凹頂藻(Laurenciapacifica)和枝狀凹頂藻(L.dendroidea)的轉(zhuǎn)錄體中鑒定出幾個萜烯合成酶基因，其中LphTPS-A是目前已知的第一個具有生物化學特征的紅藻倍半萜合成酶，被認為參與了紅藻倍半萜天然產(chǎn)物的最初生物合成途徑，能夠合成prespatane。紅藻中萜烯碳骨架的形成是由MTPSL酶完成的，MTPSL酶在系統(tǒng)發(fā)育上與典型的植物萜烯合成酶無關(guān)，由此推斷MTPSL酶很可能是起源于紅藻門[70]。

角鯊烯是綠藻合成萜類化合物中最常見的C30產(chǎn)物，其中布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)能夠產(chǎn)生大量液態(tài)烴，且只能通過MEP途徑合成萜類化合物，從B型布朗葡萄藻中分離并鑒定到的角鯊烯合成酶(SS)，能夠利用FPP為底物合成角鯊烯，將這一代謝途徑與布朗葡萄藻合成葡萄藻烯(botryococcene)的途徑相比較后發(fā)現(xiàn)布朗葡萄藻中不同三萜的代謝途徑是相似的[75]。Thapa等[76]對L型布朗葡萄藻的轉(zhuǎn)錄組測序時，破譯了一種四萜類碳氫化合物番茄八烯(lycopaoctaene)的合成途徑及其關(guān)鍵酶LOS。與SS酶不同，LOS酶對底物的專一性不強，能夠利用不同種類的底物單獨或組合合成6種不同的C30、C35和C40鏈長的碳氫化合物(圖4)，如利用GGPP合成番茄八烯，或利用FPP合成PSPP，從而轉(zhuǎn)化為角鯊烯等。在B型布朗葡萄藻的MEP途徑中，研究人員發(fā)現(xiàn)催化初始步驟的酶DXS和最后兩個步驟中的酶4-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸合酶(HDS)和4-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸還原酶(HDR)是決定其萜類化合物積累產(chǎn)量的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶[77]。除此之外，在模式綠藻萊茵衣藻中也獲得了兩種參與角鯊烯合成和代謝相關(guān)的酶：角鯊烯合成酶(CrSQS)和角鯊烯環(huán)氧化酶(CrSQE)，這兩個酶基因分別編碼與膜結(jié)合的SQS和SQE，參與萊茵衣藻中角鯊烯的合成以及代謝途徑[78]。

圖4 布朗葡萄藻中角鯊烯和番茄二烯的生物合成[76]Fig.4 Biosynthesis of squalene and lycopadiene biosynthesis in Botryococcus braunii race L[76]

檸檬烯是一種典型的植物單萜，具有廣泛的用途，而在藍藻中，檸檬烯是無法自然合成的。近年來，對檸檬烯合成酶(LimS)在藍藻中異源表達的研究逐漸增多，現(xiàn)有的關(guān)于藍藻合成檸檬烯的研究，主要利用了幾種來自不同植物(荊芥、云杉和薄荷)的limS基因[79]，這些基因被優(yōu)化后在藍藻中進行異源表達，能夠成功地合成檸檬烯。另外，藍藻也是土味素(geosmin)的主要來源，Agger等[80]在2株藍藻(PCC 7120和PCC 73102)中鑒定了3個參與合成土味素的倍半萜合成酶NS1、NP1和NP2的生理生化特性。其中，NS1和NP1屬于一個明顯的微型蛋白家族的一部分，包含1個細胞色素P450和1個位于該萜烯合成酶下方的未知混合雙組分蛋白，且P450基因與其相鄰的萜烯合成酶基因在大腸桿菌中能夠共表達，并能功能性氧化NS1催化的萜烯產(chǎn)物，這是目前所知第一個藍藻細胞色素P450基因在大腸桿菌中功能性表達的例子。

微藻具有繁殖速度快、生物量容易積累和易于遺傳操作等優(yōu)點，在代謝組學、轉(zhuǎn)錄組學、基因工程等手段的幫助下，有望發(fā)展成為一種商業(yè)化的萜類化合物的生產(chǎn)者。與化學合成的萜類化合物相比，天然萜類化合物無構(gòu)型選擇等問題，能夠表現(xiàn)出更高的潛在生物活性。

7 結(jié)論與展望

微藻既可作為細胞工廠生產(chǎn)有用的物質(zhì)，也可作為生物煉制的原料。本文綜述了微藻酶在工業(yè)生產(chǎn)、生物修復和生物監(jiān)測等方面的研究進展，微藻是發(fā)現(xiàn)新的生物催化劑的新來源，這些催化劑可以在微藻的光生物反應(yīng)器中生產(chǎn)，或者在細菌中通過異源表達合成來生產(chǎn)。隨著越來越多的微藻酶在食品、藥物和化學工業(yè)中的應(yīng)用，這為開發(fā)新策略與新方法來誘導和優(yōu)化微藻酶的生產(chǎn)，特別是微藻酶源的工業(yè)化生產(chǎn)提供重要市場。盡管微藻有潛力成為新型酶的來源，但是對這一領(lǐng)域的研究還不夠深入，很多關(guān)鍵問題沒有解決，需要進一步深入研究。與細菌、酵母或真菌相比，微藻的培養(yǎng)時間更長，并且需要額外的下游工藝技術(shù)來回收細胞內(nèi)的酶，更重要的是，大部分藻酶在細胞內(nèi)的合成量相當少，這使得微藻酶在實際應(yīng)用和工業(yè)放大生產(chǎn)時面臨挑戰(zhàn)。隨著遺傳工程和合成生物學的發(fā)展，加上在生物煉制時，使用整個藻體生產(chǎn)多種生物產(chǎn)品，為克服現(xiàn)階段微藻酶生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的限制提供了可能性，并為未來實現(xiàn)在微藻細胞中具有經(jīng)濟效益的工業(yè)酶的生產(chǎn)提供了機遇。