乳蛋白水解度檢測方法研究進展

張湘渠，張 斌，蓋麗娜，田澤晨，王一瑋，張?zhí)m天

（河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050200）

母乳是嬰幼兒最理想的營養(yǎng)來源[1]。母乳的致敏性極低，而且能夠滿足嬰幼兒生長的營養(yǎng)需求，同時增強新生兒的免疫力。但當(dāng)母乳無法滿足嬰幼兒需求時，需要選擇其他營養(yǎng)物質(zhì)來代替。牛乳因含有較豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、維生素等被人們選擇，尤其是牛乳中的必需氨基酸和非必需氨基酸均為人體生長發(fā)育所需要的，消化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于植物蛋白質(zhì)，是完全蛋白質(zhì)，因此以牛乳為原料的嬰兒配方乳粉成為母乳的最佳替代品，但是有一部分嬰幼兒食用后產(chǎn)生不適癥狀。近幾年研究開發(fā)的水解蛋白配方食品替代普通乳粉，不僅可以有效緩解嬰幼兒產(chǎn)生的不適癥狀，水解后的乳清蛋白還具有抗氧化等作用，水解蛋白配方食品的優(yōu)勢及其功能性普遍得到了消費者認(rèn)可，市場也在不斷擴大。目前國內(nèi)水解蛋白配方食品還有較大的發(fā)展空間，質(zhì)量安全問題成為此類產(chǎn)品技術(shù)改進、完善以及市場拓展的基礎(chǔ)。本文總結(jié)嬰幼兒攝入牛乳后產(chǎn)生不適癥狀的原因及現(xiàn)有的蛋白質(zhì)水解度檢測方法，為后續(xù)水解蛋白配方食品水解度檢測方法的建立提供研究思路。

1 嬰幼兒對牛乳過敏的原因

由于母乳與牛乳的組成成分存在差異，易引起部分嬰幼兒產(chǎn)生過敏反應(yīng)。牛乳中含有多種蛋白質(zhì)，統(tǒng)稱為牛乳蛋白，主要包括酪蛋白和乳清蛋白。牛乳中的酪蛋白主要為αs-酪蛋白，αs-酪蛋白使酪蛋白膠束粒子顆粒較大，而且沉淀時形成堅硬的凝塊，影響嬰幼兒的消化吸收。研究發(fā)現(xiàn)，對酪蛋白過敏的人中，對αs1-酪蛋白過敏占較大比例[2]，αs1-酪蛋白是酪蛋白中最主要的過敏原。母乳中不含有αs-酪蛋白，母乳中主要為β-酪蛋白，β-酪蛋白膠束粒子相對較小，且沉淀時為特別細(xì)微、分散的狀態(tài)。另外有研究表明，超過80%對牛乳過敏的人對β-乳球蛋白過敏。鮮牛乳中的β-乳球蛋白通常以二聚體形式存在[3]，而母乳中不含有β-乳球蛋白，因此它也被認(rèn)為是牛乳過敏的原因之一。

在通常情況下，αs-酪蛋白和β-乳球蛋白可以被人體消化吸收，對于嬰幼兒來講，由于自身消化能力不足，特別是0～6 個月的嬰兒，內(nèi)源性基因調(diào)控、外部環(huán)境抗原刺激、腸道及免疫系統(tǒng)沒有發(fā)育完全，極易引起多種過敏現(xiàn)象[4-7]，如濕疹、皮炎、腹瀉、便秘等。

鑒于此現(xiàn)象，許多嬰幼兒乳粉廠家通過生產(chǎn)工藝降低β-乳球蛋白的比例，以減少出現(xiàn)過敏癥狀的概率，卻大大增加了嬰幼兒的腎臟負(fù)擔(dān)，此方法已經(jīng)不再提倡，同時國家對特殊醫(yī)學(xué)生產(chǎn)許可標(biāo)準(zhǔn)審查規(guī)則重視度增加[8]。研究發(fā)現(xiàn)，通過特定的技術(shù)將牛乳中的大分子，如αs-酪蛋白和β-乳球蛋白，分解為分子質(zhì)量較小的多肽時，致敏性也隨之消失[9-10]。相比于普通的配方乳粉，乳蛋白水解配方食品具有致敏率低的特點，更適合腸道發(fā)育不完善的嬰幼兒，在一定程度上降低了因?qū)θ榈鞍走^敏患病的幾率[11]。

2 乳蛋白水解配方食品的種類

乳蛋白水解配方食品是針對牛乳蛋白過敏的嬰幼兒所研發(fā)的食品，水解后的乳清蛋白可以有效降低嬰幼兒過敏反應(yīng)的發(fā)病概率，將大分子蛋白質(zhì)水解成容易消化的小分子蛋白質(zhì)、肽或氨基酸，以降低牛乳蛋白的致敏性。根據(jù)蛋白水解度分為部分水解蛋白配方和深度水解蛋白配方，這2 類配方產(chǎn)品的食用人群為乳蛋白不耐受或乳蛋白輕度過敏和深度過敏的嬰幼兒。

乳蛋白配方食品含有滿足嬰幼兒生長發(fā)育需要的營養(yǎng)物質(zhì)，如脂肪、維生素、熱量、碳水化合物、礦物質(zhì)等，只是蛋白質(zhì)通過水解等工藝變成致敏性低的小分子蛋白質(zhì)、短肽或氨基酸。乳蛋白配方食品以保障營養(yǎng)需求為基礎(chǔ)，降低由乳蛋白引起的嬰幼兒發(fā)生過敏癥狀的概率。Mihatsch等[12]研究發(fā)現(xiàn)，水解蛋白配方乳粉可以有效提高嬰幼兒的耐受性，可縮短到達全腸道的時間。

2.1 部分水解蛋白配方食品

通過生物技術(shù)將牛乳蛋白分解為小分子乳蛋白，并以此為原料生產(chǎn)出的乳粉稱之為部分水解配方乳粉，蛋白分子質(zhì)量一般為3 000～10 000 Da[13]。此配方保留了一部分抗原性，在降低乳蛋白過敏現(xiàn)象的同時，增強了免疫系統(tǒng)的耐受力，因此不僅可用于非牛乳蛋白過敏嬰兒的預(yù)防，也可作為治療嬰幼兒牛乳蛋白過敏期間的飲食，作為從深度水解配方乳粉向普通配方乳粉過渡的橋梁。Bhanegaonkar等[14]研究發(fā)現(xiàn)，攝入部分水解蛋白配方乳粉的嬰兒比攝入普通乳粉的嬰兒患特應(yīng)性皮炎的概率降低14%。張少冰等[15]對179 例身體檢查正常但是便秘嬰幼兒做了2 組喂養(yǎng)對照，所有嬰兒均采用藥物、益生菌等進行治療，對照組喂食配方不變，實驗組喂食部分水解蛋白配方乳粉，研究發(fā)現(xiàn)，部分水解蛋白配方乳粉對嬰幼兒功能性便秘有很好的療效。美國兒科協(xié)會提出建議：若嬰兒存在高過敏的風(fēng)險，且此風(fēng)險來自于明顯家族過敏史，建議母乳喂養(yǎng)或食用部分水解配方乳粉。

2.2 深度水解蛋白配方食品

通過生物技術(shù)將牛乳蛋白分解為分子質(zhì)量小于3 000 Da的短肽，以此為原料生產(chǎn)出的乳粉稱之為深度水解配方乳粉，主要用于對牛乳蛋白過敏的治療[16]。

研究發(fā)現(xiàn)，以早產(chǎn)兒配方乳粉為營養(yǎng)來源的患兒和喂養(yǎng)深度水解配方乳粉的早產(chǎn)兒生長速度基本一致，證明深度水解配方乳粉可以滿足對牛乳過敏的早產(chǎn)兒的營養(yǎng)需求。羅智花等[17]研究深度水解蛋白配方乳粉對早產(chǎn)新生兒的影響，實驗組喂食深度水解蛋白配方乳粉，對照組喂食早產(chǎn)兒配方乳粉，結(jié)果表明，深度水解配方乳粉可以有效降低早產(chǎn)兒乳蛋白不耐受的發(fā)生概率。

3 現(xiàn)有蛋白質(zhì)水解度測定方法

3.1 蛋白質(zhì)水解度定義

蛋白質(zhì)水解是蛋白質(zhì)通過化學(xué)方法或在水解酶的催化作用下水解過程的統(tǒng)稱，水解度代表水解過程中蛋白質(zhì)中被裂解的肽鍵數(shù)（h，mmol/g）和總肽鍵數(shù)（htot，mmol/g）的比值，按下式計算。

式中：若蛋白質(zhì)的性質(zhì)確定，那么htot為已知常數(shù)，可從相關(guān)文獻中查詢。因此，蛋白質(zhì)中被裂解的肽鍵數(shù)（h）成為確定水解度大小的關(guān)鍵點。

3.2 蛋白質(zhì)水解度測定方法

國內(nèi)外常見的測定食品中蛋白質(zhì)水解度的方法有pH-stat法、三硝基苯磺酸（trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）法、茚三酮法、甲醛滴定法和鄰苯二甲醛（phthalaldehyde，OPA）法。

3.2.1 pH-stat法

蛋白質(zhì)水解過程中伴隨著質(zhì)子的釋放和吸收，此反應(yīng)需要在中性或微堿性環(huán)境中進行，為了維持體系的pH值穩(wěn)定，需隨時加入酸或堿，根據(jù)消耗的堿或酸的量來衡量蛋白質(zhì)水解程度，其原理為滴定蛋白質(zhì)水解過程中釋放出的質(zhì)子，進而得出水解度[18-20]。國外主要采用此方法，操作簡單、快捷、可重復(fù)性高。但是需要其他的方法，如OPA法來校正，且需要一套特殊的儀器設(shè)備來控制水解過程中的pH值，一般實驗室無此設(shè)備。周慧江等[21]應(yīng)用pH-stat法測定核桃蛋白水解物水解度，證明該法較為準(zhǔn)確，但需要特殊儀器校正。袁斌等[22]在pH-stat法基礎(chǔ)上建立了一種簡便方法，適用于無需恒定水解液pH值的水解反應(yīng)。葉健明等[23]用pH-stat法對鷹嘴豆短肽的水解度進行了測定。

3.2.2 TNBS法

Adler-Nissen[24]對TNBS法做了詳細(xì)的描述，該法通過游離氨基酸與TNBS反應(yīng)生成在340 nm波長處有最大吸收峰的物質(zhì)。反應(yīng)環(huán)境為弱堿性，當(dāng)環(huán)境條件轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝詴r反應(yīng)終止。此方法測定結(jié)果相對穩(wěn)定，但實驗過程中需要的保溫與冷卻時間較長，不能實現(xiàn)水解度的實時監(jiān)測，且實驗所用試劑在實驗室不常見，TNBS試劑的穩(wěn)定性較差，易被苦味酸污染，導(dǎo)致測定空白值偏高，并且有毒，存在爆炸的危險性，必須小心操作。

3.2.3 茚三酮法

茚三酮和α-氨基酸反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)，這種藍(lán)紫色化合物有一定的吸光度，從而能夠得到水解后溶液中游離－NH2的量，計算得出水解度。此方法簡單易行，但是配制的顯色劑穩(wěn)定性較差，易與氧發(fā)生反應(yīng)，影響測定結(jié)果，且需要較長的時間加熱和冷卻用于發(fā)色團的生成。不同氨基酸與水合茚三酮發(fā)生反應(yīng)時的顯色存在差異，導(dǎo)致測定結(jié)果有偏差。郭興鳳[25]對此方法做了改進，以待水解液的完全水解液作為其標(biāo)準(zhǔn)，從而解決了因不同氨基酸與水合茚三酮反應(yīng)的顯色差異導(dǎo)致的結(jié)果偏差，使結(jié)果更準(zhǔn)確。

3.2.4 甲醛滴定法

甲醛滴定法[26]是利用甲醛與氨基酸的反應(yīng)，生成羥甲基衍生物，使－NH3＋上的H＋游離出來，用滴定堿的用量確定氨基氮含量，進而計算出游離氨基酸含量。滴定量隨著水解程度的增加而增加，當(dāng)水解完全后，滴定值恒定。此方法簡單易行，但是脯氨酸和甲醛作用有不穩(wěn)定化合物產(chǎn)生，導(dǎo)致滴定體積減少，測定值偏低。而酪氨酸由于自身酚基結(jié)構(gòu)會使測定結(jié)果偏高。姚玉靜等[27]將此法應(yīng)用于乙醇萃取牡蠣、雞肉和南極磷蝦的3 種酶解產(chǎn)物鮮味肽的水解度測定。徐勤等[28]對此法做了改進，測定大豆蛋白水解度，提高了測定結(jié)果準(zhǔn)確度。

3.2.5 OPA法

在堿性條件下，蛋白質(zhì)的－NH2與OPA發(fā)生反應(yīng)，生成在340 nm波長條件下有最大吸收峰的異吲哚衍生物，用分光光度計可檢測其光密度。OPA法快速、方便、精準(zhǔn)，可以進行即時監(jiān)測，所用儀器、試劑在實驗室常見。Nielsen等[29]根據(jù)TNBS法的特點，對OPA法進行了改進，優(yōu)化了不足。但是國內(nèi)卻很少有OPA法的相關(guān)報道。林虬等[30]在此基礎(chǔ)上建立了OPA法，測定棉籽蛋白水解物的水解度，證明此法較甲醛滴定法和茚三酮法快捷、簡便、靈敏度高、重復(fù)性好，且不會對環(huán)境產(chǎn)生影響。Leni等[31]應(yīng)用OPA法測定昆蟲蛋白的水解度。

4 結(jié) 語

對于無法以母乳為主要營養(yǎng)來源的嬰幼兒來說，需要過早與牛乳、雞蛋或其他營養(yǎng)價值豐富的食物接觸，這些食物中常常含有致敏性的蛋白[32-34]，由于嬰幼兒自身腸道發(fā)育不完全，發(fā)生過敏反應(yīng)的概率大大增加。目前除母乳外，水解蛋白配方乳粉成為最佳選擇。通過對蛋白質(zhì)進行水解能有效減少過敏原獨特型抗原表位的空間構(gòu)象及序列，顯著降低抗原性，從而降低嬰幼兒對乳蛋白的過敏反應(yīng)。但如果蛋白質(zhì)水解過度，會導(dǎo)致水解產(chǎn)物出現(xiàn)苦味，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的風(fēng)味。因此，水解度不僅是衡量乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方中乳蛋白水解程度的重要質(zhì)量指標(biāo)，而且關(guān)系著嬰幼兒食用的安全性，其研究對于監(jiān)管特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的安全、保障嬰幼兒的身體健康和生命安全具有重要意義。

目前國內(nèi)外開發(fā)出的水解蛋白配方食品種類越來越多，國外已經(jīng)將研究低敏性配方食品作為重點，與歐美國家相比較，國內(nèi)相關(guān)報道和研究較少。國家、行業(yè)、地方等方法標(biāo)準(zhǔn)體系中，均無乳蛋白水解配方食品水解度檢測方法。

現(xiàn)有的蛋白質(zhì)水解度檢測方法中，pH-stat法由于步驟繁瑣且需要其他方法校正，同時受到特殊儀器的制約，國內(nèi)很少采用。TNBS法實驗數(shù)據(jù)相對可靠，但試劑較難購買。茚三酮法由于顯色劑穩(wěn)定性較差，上機比色時讀數(shù)不穩(wěn)，很難讀出準(zhǔn)確值[34-35]，易導(dǎo)致測定結(jié)果偏差。甲醛滴定法簡單易行，但由于試劑自身性質(zhì)，導(dǎo)致測定結(jié)果偏低。Panasiuk[36]、徐勤[28]等的研究同樣證明了茚三酮比色法及甲醛滴定法測定的水解度比OPA法的測定結(jié)果偏低許多。由于OPA法優(yōu)于上述方法，更快捷、精準(zhǔn)、不受試劑和儀器制約，可被用于建立乳蛋白水解配方食品水解度檢測方法。