特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉中左旋肉堿含量測(cè)定方法優(yōu)化

馬曉博，吳 磊，張 斌，張?zhí)m天，蓋麗娜

（河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200）

左旋肉堿又被稱為維生素BT，是一種類維生素營(yíng)養(yǎng)素，其作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑廣泛應(yīng)用于嬰幼兒食品、減肥類保健品、中老年人營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充食品中[1-4]。左旋肉堿通過調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)?；谋壤?，促進(jìn)支鏈氨基酸正常代謝，在嬰兒利用脂肪作為能量來源的代謝中起著重要作用，因此左旋肉堿是嬰幼兒必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[5-7]。GB 25596—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品通則》[8]和GB 29922—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品通則》[9]規(guī)定，左旋肉堿作為特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的可選擇性成分，其添加量≥0.3 mg/kJ。特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品作為嬰幼兒早期甚至長(zhǎng)期賴以生存的主要食物來源，其質(zhì)量應(yīng)得到嚴(yán)格控制[5]。

目前，左旋肉堿的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、質(zhì)譜法、離子色譜法和分光光度法等[10-18]。GB 29989—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的測(cè)定》[19]中的檢測(cè)方法為分光光度法，該方法較其他方法具有操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，是目前檢測(cè)機(jī)構(gòu)普遍采用的方法[19-20]。本研究在GB 29989—2013的基礎(chǔ)上，針對(duì)特定基質(zhì)配方的特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉，從標(biāo)準(zhǔn)曲線制作、樣品前處理、乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶配制等幾個(gè)方面進(jìn)行分析優(yōu)化，研究其對(duì)左旋肉堿測(cè)定的影響，為特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉檢測(cè)提供參考[21]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售嬰幼兒配方乳粉、氨基酸配方、乳蛋白深度水解和部分水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒食品（3 類特殊醫(yī)學(xué)用途乳粉配料均含有麥芽糊精），各10 批次。

α-淀粉酶（酶活力≥3.7 U/mg） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙二胺四乙酸二鈉、高氯酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀（均為分析純） 天津永大化學(xué)試劑有限公司；乙酰輔酶A、乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶 美國(guó)Sigma試劑公司；2-硝基苯甲酸、N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.5%） 北京曼哈格生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2700紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津儀器有限公司；MS204S/01電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；CT15RT高速冷凍離心機(jī) 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；TWS-24恒溫水浴鍋 上海喆圖科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（78.8 μg/mL）：準(zhǔn)確稱取20 mg于（102±2） ℃烘箱中烘干2 h的左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水定容至250 mL容量瓶。

左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 mL于25 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，混勻，該系列標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度分別為0.788、1.576、3.152、6.304、9.456、15.760 μg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

乙酰輔酶A溶液：稱取20.0 mg乙酰輔酶A，溶于2.0 mL去離子水中?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液：吸取100 μL乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶懸浮液，6 000 r/min離心10 min，棄去上層清液，沉淀用2 mL去離子水溶解?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

顯色儲(chǔ)備液：分別稱取50 mg 2-硝基苯甲酸、5.96 mgN-2-羥乙基哌嗪-2-乙烷磺酸、185 mg乙二胺四乙酸二鈉，溶于30 mL去離子水中，用10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4～7.6，然后用去離子水定容至50 mL。

顯色工作液：吸取5.0 mL顯色儲(chǔ)備液，用去離子水定容至25 mL。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g（精確至0.000 1 g）混合均勻的乳粉試樣于燒杯中，用30 mL 40 ℃溫水溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，準(zhǔn)確加入0.25 gα-淀粉酶，混勻后于50 ℃水浴酶解30 min；取出冷卻，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)13%高氯酸溶液，混勻靜置20 min；用蒸餾水定容至刻度，搖勻，用定量快速濾紙過濾。

待測(cè)液制備：取濾液20 mL于50 mL離心管中，用4 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH 12.5～13.0，置于40 ℃水浴60 min；取出冷卻后，先用體積分?jǐn)?shù)13%高氯酸溶液調(diào)節(jié)pH 9.5～10.0，再用體積分?jǐn)?shù)5%高氯酸溶液調(diào)節(jié)pH 7.0～7.5；將樣液移入50 mL容量瓶，用去離子水定容，將樣液置于4 ℃冰箱中過夜，取出放置至室溫，用一次性醫(yī)用注射器吸取上清液，通過0.45 μm水基膜過濾于50 mL離心管內(nèi)，備用。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及試樣測(cè)定

分別吸取左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)工作液和試樣待測(cè)液2 mL于1 cm比色皿中，依次加入0.8 mL顯色工作液和0.1 mL乙酰輔酶A溶液，用滴管混勻，置于分光光度計(jì)樣品槽，空白比色皿中放蒸餾水。將波長(zhǎng)設(shè)置為412 nm，5 min后歸零。迅速加入0.1 mL左旋肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液，混勻，反應(yīng)10 min后記錄吸光度。以左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中左旋肉堿含量按下式計(jì)算。

式中：ρ為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的試樣處理液質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為濾液體積/mL；m為試樣質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線優(yōu)化

與GB 29989—2013相比，本研究增加吸取0.25 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0.788 μg/mL作為標(biāo)準(zhǔn)曲線第1點(diǎn)。依據(jù)GB 29989—2013，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度分別為1.576、3.152、6.304、9.456、15.760 μg/mL繪制所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.055 3x＋0.008 0（R2=999 9）；以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度分別為0.788、1.576、3.152、6.304、9.456、15.760 μg/mL繪制所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.055 4x＋0.005 6（R2=999 9），2 條標(biāo)準(zhǔn)曲線無明顯差異。標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.789～15.776 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。實(shí)際樣品檢測(cè)過程中，部分左旋肉堿含量低于7.5 mg/100 g的特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉吸光度低于0.092 8（稱樣量5 g，吸光度0.090 9），導(dǎo)致結(jié)果不在第2條標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。質(zhì)量濃度最低點(diǎn)（0.788 μg/mL）吸光度8 次測(cè)定結(jié)果分別為0.046 2、0.046 1、0.046 1、0.045 9、0.046 2、0.046 0、0.045 9、0.046 3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.32%，表明該點(diǎn)吸光度穩(wěn)定。因此，對(duì)于低含量左旋肉堿樣品，檢測(cè)過程應(yīng)采用第2條標(biāo)準(zhǔn)曲線[21]。

2.2 乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液制備轉(zhuǎn)速優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶懸浮液經(jīng)1 500 r/min離心10 min，上清液未完全澄清，棄去上清液會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)移酶實(shí)際含量降低。

研究乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶懸浮液離心轉(zhuǎn)速與上清液透光率的關(guān)系，透光率采用紫外-可見分光光度計(jì)直接測(cè)定。由圖1可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液的透光率明顯增大，轉(zhuǎn)速為5 500 r/min后趨于穩(wěn)定，因此確定6 000 r/min為最佳轉(zhuǎn)速。

圖1 乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液透光率隨離心轉(zhuǎn)速的變化Fig. 1 Change in transmittance of acetylcarnitine transferase solution with centrifugal speed

2.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

在檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)氨基酸配方、乳蛋白深度水解配方和部分水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉存在如下問題：經(jīng)高氯酸沉淀蛋白質(zhì)后試樣溶液過濾困難，影響實(shí)驗(yàn)效率；制得試樣備用液顏色較深，影響吸光度測(cè)定；加標(biāo)回收率較低等。原因是樣品配料中添加的麥芽糊精黏度較大，會(huì)附著濾紙孔，導(dǎo)致過濾速度較慢和濾液渾濁；同時(shí)高氯酸沉淀劑不能將其沉淀下來，堵塞濾紙孔，導(dǎo)致過濾較慢且濾液渾濁[21-25]。因此，通過向試樣中加入淀粉酶以消除麥芽糊精的影響，本研究通過優(yōu)化確定淀粉酶最優(yōu)添加量及其最佳水解溫度和水解時(shí)間。

2.3.1 淀粉酶添加量

5 g（精確至0.000 1 g）混合均勻的乳粉，測(cè)定淀粉酶添加量分別為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 g時(shí)濾液的透光率。由圖2可知，隨著淀粉酶添加量的增加，樣液透光率顯著增大，并于淀粉酶添加量0.20 g之后趨于穩(wěn)定，因此確定0.25 g為最佳淀粉酶添加量。

圖2 樣液透光率隨淀粉酶添加量的變化Fig. 2 Change in light transmittance of sample solution with the amount of enzyme added

2.3.2 水解溫度

測(cè)定水解溫度分別為30、35、40、45、50、60、70、80 ℃時(shí)濾液的透光率。由圖3可知，樣液的透光率隨著水解溫度的增加不斷增大，并且在45 ℃時(shí)基本趨于穩(wěn)定，考慮到特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉復(fù)雜基質(zhì)的影響，確定最佳水解溫度為50 ℃。

圖3 樣液透光率隨水解溫度的變化Fig. 3 Change in light transmittance of sample solution with hydrolysis temperature

2.3.3 水解時(shí)間

測(cè)定水解時(shí)間分別為10、15、20、25、30、40、50、60 min時(shí)樣液的透光率。由圖4可知，隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)，樣液透光率逐漸增大，并在20 min后逐漸趨于穩(wěn)定?？紤]到特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉復(fù)雜基質(zhì)的影響，確定最佳水解時(shí)間為30 min。

圖4 樣液透光率隨水解時(shí)間的變化Fig. 4 Change in light transmittance of sample solution with hydrolysis time

因此，特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉最佳實(shí)驗(yàn)條件為：標(biāo)準(zhǔn)曲線以0.25 mL為最低點(diǎn)，乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶懸浮液離心轉(zhuǎn)速為6 000 r/min，添加α-淀粉酶0.25 g，在50 ℃時(shí)水解30 min。

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

選取普通嬰幼兒配方乳粉、氨基酸配方、乳蛋白深度水解配方和部分水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉，采用GB 29989—2013方法和本研究?jī)?yōu)化后方法測(cè)定左旋肉堿含量，并計(jì)算RSD。

由表1可知，對(duì)于普通嬰兒配方乳粉，國(guó)標(biāo)法測(cè)得左旋肉堿平均值為18.925 mg/100 g，RSD為2.36%，優(yōu)化法測(cè)得平均值為19.063 mg/100 g，RSD為2.29%。2 種方法測(cè)得數(shù)值基本一致，且滿足GB 29989—2013規(guī)定要求。對(duì)于氨基酸配方乳粉，國(guó)標(biāo)法測(cè)得左旋肉堿平均值為7.875 mg/100 g，RSD為14.3%；優(yōu)化法測(cè)得平均值為9.213 mg/100 g，RSD為3.71%。對(duì)于乳蛋白深度水解配方乳粉，國(guó)標(biāo)法測(cè)得左旋肉堿平均值為6.275 mg/100 g，RSD為8.57%；優(yōu)化法測(cè)得平均值為7.125 mg/100 g，RSD為2.57%。對(duì)于乳蛋白部分水解配方乳粉，國(guó)標(biāo)法測(cè)得左旋肉堿平均值為9.938 mg/100 g，RSD為14.0%；優(yōu)化法測(cè)得平均值為11.825 mg/100 g，RSD為3.93%。說明對(duì)于此3 種類型特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉，采用優(yōu)化后的方法，樣品測(cè)定精密度才符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的要求[26]。

表1 2 種前處理方法測(cè)得的左旋肉堿含量（n=8）Table 1 Contents of L-carnitine in infant formula samples determined by traditional and optimized methods (n = 8)

2.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

選取普通嬰兒配方乳粉、氨基酸配方、乳蛋白深度水解配方、乳蛋白部分水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定。

由表2可知，在3 個(gè)不同的加標(biāo)水平下，對(duì)于普通嬰兒配方乳粉，國(guó)標(biāo)法平均加標(biāo)回收率為92.475%～99.800%，RSD為1.11%～3.43%，優(yōu)化法平均加標(biāo)回收率為93.813%～99.900%，RSD為1.36%～2.78%。說明對(duì)于普通嬰兒配方乳粉，國(guó)標(biāo)法樣品加標(biāo)回收率和RSD符合實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制要求[26]。對(duì)于氨基酸配方乳粉，國(guó)標(biāo)法平均加標(biāo)回收率為81.138%～84.175%，RSD為7.78%～8.69%；優(yōu)化法平均加標(biāo)回收率為94.138%～100.100%，RSD為3.27%～4.12%。對(duì)于乳蛋白深度水解配方乳粉，國(guó)標(biāo)法平均加標(biāo)回收率為83.850%～86.975%，RSD為6.68%～7.97%；優(yōu)化法平均加標(biāo)回收率為100.288%～102.263%，RSD為2.68%～3.07%。對(duì)于乳蛋白部分水解配方乳粉，國(guó)標(biāo)法平均加標(biāo)回收率為73.950%～79.775%，RSD為4.06%～6.55%；優(yōu)化法平均加標(biāo)回收率為89.412%～92.088%，RSD為1.71%～3.50%。說明對(duì)于特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉，經(jīng)優(yōu)化法處理樣品的加標(biāo)回收率和RSD符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制要求[26]。

表2 2 種前處理方法測(cè)得的加標(biāo)回收率（n=8）Table 2 Spiked recoveries of traditional and optimized methods (n = 8)

3 結(jié) 論

優(yōu)化一種特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉中左旋肉堿含量的測(cè)定方法。通過增加標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)、增大酶提取離心轉(zhuǎn)速、優(yōu)化前處理過程等手段，解決了氨基酸配方、乳蛋白深度水解配方和部分水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉試樣溶液過濾困難、測(cè)定液顏色較深影響吸光度測(cè)定和加標(biāo)回收率較低的問題。該方法可以縮短前處理時(shí)間，提高檢測(cè)效率，滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的要求。對(duì)于其他基質(zhì)配方的特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉，該方法的適用性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。