當歸芍藥散加味方對乳腺增生大鼠Let-7a、p-ERK表達的影響

張婷婷，王 蘋，張建偉

（福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，福建 福州350122）

近年來，隨著對乳腺腫瘤發(fā)病機制研究的不斷深入，通過RNA干擾在乳腺腫瘤治療中的應用有了很大的進步。研究發(fā)現(xiàn)，一些微小的干擾RNA對腫瘤細胞中的信號轉導、細胞凋亡、分化等過程有顯著的抑制作用［1］。而Let-7a就是一種微小RNA，能通過調節(jié)轉錄因子在RNA轉錄后起到調節(jié)作用，在許多腫瘤細胞的生長及分化中發(fā)揮重要作用。本文選擇乳腺增生模型大鼠為研究對象，以當歸芍藥散加味方為治療組，通過實時定量PCR法檢測模型大鼠乳腺上皮細胞Let-7a基因的表達，以探討當歸芍藥散加味方治療乳腺增生病可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物40只SPF級SD雌性健康未孕大鼠，10周齡，體質量（193.78±5.78）g，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心，合格證號：2015000545959。

1.2 實驗藥物 當歸芍藥散加味方方藥組成：當歸15 g，芍藥15 g，川芎8 g，茯苓10 g，白術15 g，澤瀉10 g，浙貝母12 g，柴胡8 g，香附12 g，丹參15 g，由福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院中藥房提供。常規(guī)煎煮后減壓濃縮至所需濃度（含生藥1 g／mL），放置于冰箱儲存?zhèn)溆?。乳消Ⅲ膠囊由福建省第二人民醫(yī)院制劑科提供（院內制劑，批準文號：閩藥制字Z05104028）。

1.3 實驗試劑 苯甲酸雌二醇注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司）；黃體酮注射液（浙江仙琚制藥股份公司）；10%水合氯醛溶液、RNAiso plus［寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司］；焦碳酸二乙脂（DEPC）水（中國索萊寶科技有限公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）［寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司］；Fast SYBR Green Master Mix（2×）（美國ABI公司）。

1.4 實驗儀器 生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；低速離心機［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；NanoDrop 2000超微量分光光度計（美國Thermo公司）；7500 Real time-PCR儀（美國ABI公司）。

2 實驗方法

2.1 造模與分組 將40只SPF級SD雌性健康未孕大鼠，常規(guī)適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為空白組8只和實驗組32只。實驗組采用乳腺增生病動物模型經(jīng)典造模法，即雌、孕激素聯(lián)合序貫給藥法，首先在大鼠后外肢外側肌注苯甲酸雌二醇，劑量標準按體質量0.5 mg／（kg·d），每日1次，左右交替進行，連續(xù)肌注25 d；然后改用黃體酮繼續(xù)肌肉注射，劑量標準按體質量5 mg／（kd·d），每日1次，連續(xù)5 d?？瞻捉M則用生理鹽水按照0.1 mL／只肌肉注射，每日1次，連續(xù)30 d。造模結束后，將實驗組隨機分為模型1組、模型2組、當歸芍藥散加味方組、乳消Ⅲ膠囊組，每組各8只。隨后即刻處死模型1組，先用肉眼觀察乳腺組織的外表形態(tài)，然后用游標卡尺檢測第二對乳房乳頭的高度、直徑，接著將第2對乳房完好剝離，用10%福爾馬林液固定，待實驗結束后做病理觀察、RT-qPCR及免疫組化檢測。

2.2 干預 雌、孕激素聯(lián)合給藥造模完成后，當歸芍藥散加味方組按含生藥量1 g／（kg·d）予當歸芍藥散加味方藥液灌胃；乳消Ⅲ膠囊組按0.7g／（kg·d）予乳消Ⅲ膠囊藥液灌胃；模型2組與空白組予等體積生理鹽水灌胃，均連續(xù)灌胃30 d。實驗結束后以上32只大鼠無死亡、均存活。

2.3 取材 大鼠灌胃30 d后，禁食24 h。運用腹腔注射麻醉藥的方法，根據(jù)每公斤體質量注射1 mL的10%水合氯醛后，處死大鼠，游標卡尺測第2對乳頭高度和直徑，然后剝離大鼠第2對乳房，用肉眼觀察大鼠乳腺組織的外表、稱重；最后用10%福爾馬林溶液固定，待做病理學觀察、RT-qPCR檢測及免疫組化的檢測。

2.4 病理學觀察 常規(guī)取材乳腺組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋切片及HE染色之后，用光學顯微鏡觀察大鼠乳腺組織切片的組織學變化。

2.5 RT-qPCR檢測乳腺組織Let-7a mRNA表達

提取乳腺組織的總RNA并進行質檢，按說明書要求進行RT反應：2×miRNA Reaction Buffer Mix 10 μL，miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 2 μL，Total RNA 1 μL，RNase Free dH2O 7 μL，混勻后按37℃60 min，85℃5 s在PCR儀上進 行反應。反應體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，PCR引物F 0.8 μL，通用引物R 0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，RT溶液2 μL，RNase Free dH2O 6 μL，混勻后按95℃預變性30 s，95℃變性3 s，60℃退火延伸30 s，循環(huán)40次并建立溶解曲線。擴增結束后，根據(jù)在每次循環(huán)延伸處收集熒光信號，分析整理數(shù)據(jù)。

2.6 免疫組化法檢測p-ERK蛋白表達 采用免疫組化法S-P法檢測乳腺上皮組織p-ERK蛋白的表達。先切取部分大鼠乳腺組織進行脫蠟水化，再加入20 g／mL的蛋白酶K消化20 min，接著用3%H2O2進行阻斷，最后倒入p-ERK一抗過夜處理，按試劑盒步驟操作，DAB顯色，蘇木素復染，干燥封片。

2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行處理分析。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用方差分析。

3 結 果

3.1 5組大鼠乳頭直徑、高度比較 見表1。

表1 5組大鼠乳頭直徑、高度比較（±s）mm

表1 5組大鼠乳頭直徑、高度比較（±s）mm

注：與空白組比較，1）P＜0.01；與模型2組比較，2）P＜0.01。

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3.2 5組大鼠乳腺組織形態(tài)學變化 空白組大鼠乳房未見到明顯的乳腺導管擴張，腺小葉和腺泡結構均正常。模型1組和模型2組小葉、腺泡、導管的數(shù)量明顯增多，腺泡之間排列緊密甚至部分出現(xiàn)相互融合，腺泡腔增大，導管管腔擴張，管腔內可見脫落的上皮細胞分泌物，導管上皮增生，間質充血，水腫，小葉間及導管周圍纖維結締組織增生。乳消Ⅲ膠囊組少量的乳腺導管上皮增生但無明顯乳頭形成，腺泡上皮輕度增生但未充滿囊腔，未見囊泡。當歸芍藥散加味方組接近空白組。見圖1。

圖1 5組大鼠乳腺組織HE染色圖（×100）

3.3 5組大鼠乳腺組織Let-7a mRNA表達比較見表2。

表2 5組大鼠乳腺組織Let-7a mRNA表達比較（±s）

表2 5組大鼠乳腺組織Let-7a mRNA表達比較（±s）

注：與空白照組比較，1）P＜0.05；與模型2組比較，2）P＜0.05；與乳消Ⅲ膠囊組比較，3）P＜0.05。

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3.4 5組大鼠乳腺組織p-ERK蛋白表達比較 見表3、圖2。

圖2 5組大鼠乳腺組織免疫組化染色圖（×100）

表3 5組大鼠乳腺組織p-ERK蛋白表達比較（±s）

表3 5組大鼠乳腺組織p-ERK蛋白表達比較（±s）

注：與空白照組比較，1）P＜0.01；與模型2組比較，2）P＜0.01；與乳消Ⅲ膠囊組比較，3）P＜0.01。

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4 討 論

乳腺增生病是一種對激素依賴性很大的疾病，其中雌、孕激素的比例失衡是引發(fā)本病發(fā)生的關鍵。運用雌孕激素聯(lián)合造模的方法，因其重復性良好，穩(wěn)定可靠，又操作便捷，是目前動物實驗研究中最常用的造模方法［2］。本實驗即采用雌、孕激素聯(lián)合造模方法，同時也考慮大鼠乳腺組織在停止造模后是否存在自愈傾向，為此本研究設計了模型1組和模型2組，模型1組在停止造模后隨即處死，取下乳腺組織，與實驗結束后模型2組比較是否存在自愈傾向。本實驗結果顯示，各實驗組大鼠與空白組比較，大鼠乳頭直徑和乳頭高度均明顯增大（P＜0.01），光鏡下觀察各實驗組大鼠乳腺組織，均發(fā)生顯著的增生性改變。且模型1組和模型2組在乳頭直徑、乳頭高度及乳腺組織形態(tài)學方面比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。說明本實驗造模成功，且停止雌孕激素造模后，大鼠乳腺增生無自愈傾向。

Let-7a最早由JOHNSON等發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中出現(xiàn)了表達，他們通過實驗證實，Let-7a具有抑制肺癌腫瘤細胞生長的作用［3］。隨后AKAO等［4］在大腸癌實驗中也發(fā)現(xiàn)Let-7a的表達，并有抑制腸癌細胞 生 長 的 作 用，SAMPSON等［5］在 對 伯 基 特 淋 巴 瘤的實驗研究中也發(fā)現(xiàn)Let-7a具有抑制伯基特淋巴瘤生長的作用。同樣在乳腺癌的研究中，學者們運用miRNA芯片技術也證實Let-7a亦存在異常表達。另外，相關研究也表明Let-7家族類miRNAs都可能具有腫瘤抑制作用，是一種潛在的抑制癌基因家族，其中Let-7a／b／c這三個基因表達與乳腺癌預后 關 系 密 切［6］。張 碩 等［7］也 發(fā) 現(xiàn)，Let-7家 族 成 員Let-7c-5p能夠抑制乳腺癌中長鏈非編碼RNA（lncRNA）漿細胞瘤轉化遷移基因1（PVT1），通過提高Let-7c-5p的表達會抑制乳腺癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，說明Let-7c-5p的表達量具有抑癌作用。但目前相關研究中關于Let-7a對乳腺增生病的影響研究相對較少。本實驗結果顯示，各實驗組大鼠乳腺組織Let-7a基因表達量均較空白組明顯降低（P＜0.05），說明乳腺增生病發(fā)生與Let-7a基因表達下降有關；在治療組中，當歸芍藥散加味方組和乳消Ⅲ膠囊組大鼠乳腺組織Let-7a基因表達量均較模型2組升高（P＜0.05），當歸芍藥散加味方組大鼠Let-7a基因表達量較乳消Ⅲ膠囊組提高（P＜0.05），提示通過中藥可提高大鼠乳腺組織Let-7a基因的表達，降低乳腺上皮細胞增殖活躍性，改善大鼠乳腺組織的增生狀態(tài)，同時當歸芍藥散加味方療效優(yōu)于乳消Ⅲ膠囊組。

ERK信號通路是目前已知與細胞生長、分化、增殖密切相關的轉導途徑，而p-ERK蛋白是ERK信號通路上的重要蛋白，其是ERK磷酸化后存在的活性表現(xiàn)形式。p-ERK蛋白可以干擾ERK信號通路的正常轉導過程、調節(jié)細胞周期變化，進一步影響細胞的正常增殖、分化及凋亡的過程。正常細胞的癌變過程與p-ERK蛋白干擾ERK信號通路的轉導過程出現(xiàn)異常有著因果聯(lián)系。當p-ERK蛋白進入到細胞核中參與轉錄調節(jié)時，激發(fā)癌細胞的活性，從而使得正常細胞轉化為惡性［8］，當p-ERK蛋白出現(xiàn)表達過度或者異常的時候，可加快細胞的增殖和分化。因此通過干預p-ERK蛋白的表達強度，可以影響ERK信號通路的轉導過程，進一步對細胞周期起到調節(jié)、促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，阻斷乳腺增生的發(fā)展及癌變的發(fā)生。本研究結果顯示，實驗組大鼠乳腺組織p-ERK蛋白表達量均高于空白組，這表明當p-ERK蛋白表達增強時可引發(fā)乳腺增生病的發(fā)生；模型2組的大鼠乳腺組織p-ERK蛋白表達量高于乳消Ⅲ膠囊組和當歸芍藥散加味方組，當歸芍藥散加味方組大鼠p-ERK蛋白表達量低于乳消Ⅲ膠囊組。提示通過中藥干預影響p-ERK蛋白激活，進而抑制細胞增殖、分化，促進細胞凋亡，改善乳腺組織增生狀態(tài)，這對于防止乳腺增生的發(fā)展及癌前病變具有重要意義，且當歸芍藥散加味方組療效優(yōu)于乳消Ⅲ膠囊組。

綜上，乳腺增生模型大鼠乳腺組織中出現(xiàn)Let-7a基因與p-ERK蛋白的異常表達，當Let-7a基因出現(xiàn)低表達時，p-ERK蛋白則表現(xiàn)出高表達，說明乳腺增生病的發(fā)生與Let-7a和p-ERK的異常表達相關。當歸芍藥散加味方可以減輕乳腺增生模型大鼠乳腺組織增生程度，其作用機理可能與促進Let-7a基因表達、降低p-ERK表達，抑制乳腺組織細胞增殖的活性從而達到改善乳腺組織增生的狀態(tài)，實現(xiàn)治療乳腺增生病的目的。本次研究通過探討當歸芍藥散加味方治療乳腺增生病可能的作用機理，為研發(fā)中藥制劑治療乳腺增生病提供一定的現(xiàn)實意義。