榮筋拈痛方含藥血清對骨關(guān)節(jié)炎大鼠SDF-1／CXCR4信號通路的影響

陳 俊，鄭若曦，張 婷，戴雨婷，葉錦霞，3，吳廣文，3*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122；3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是中老年人群中常見的一種關(guān)節(jié)疾患，發(fā)病部位可位于膝關(guān)節(jié)等全身多處關(guān)節(jié)，常表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和活動受限，嚴(yán)重者可致畸致殘，對患者日常的工作生活帶來極大困擾［1］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，OA與炎癥和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)［2-3］。因此，調(diào)控炎癥環(huán)境和應(yīng)激是治療OA的有效途徑，而基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell-derived faceor-1，SDF-1）與趨化因子CXC基序受體4（chemokine C-X-C motif receptor 4，CXCR4）信號通路在炎癥反應(yīng)方面具有重要作用［4］。榮筋拈痛方源于國醫(yī)大師陳可冀院士《清宮配方集成》［5］中治療骨痹的高頻、核心用藥組方，包括牛膝、當(dāng)歸、獨(dú)活等六味藥，具有補(bǔ)肝腎、壯筋骨、祛風(fēng)濕、止痹痛的功效［6］。前期研究發(fā)現(xiàn)，榮筋拈痛方可有效改善膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）患者的臨床癥狀［7］，延 緩 軟 骨 退 變［8-9］，但 是 否 通 過 調(diào) 節(jié)SDF-1／CXCR4信號通路發(fā)揮作用，尚不明確。本研究以SD大鼠OA滑膜細(xì)胞和退變軟骨細(xì)胞為研究對象，觀察榮筋拈痛方含藥血清對SDF-1／CXCR4信號通路相關(guān)調(diào)節(jié)因子的影響，探討榮筋拈痛方治療OA的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物2月齡SPF級SD大鼠45只和4周齡SPF級SD大鼠6只均購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，合格證號：SCXK（滬）2019-0007。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 榮筋拈痛方包括牛膝、當(dāng)歸、獨(dú)活等六味藥，購于閩侯縣上街致誠醫(yī)藥商店。制備方法：按固液比1∶10加入蒸餾水進(jìn)行回流提取，提取3次，每次1.5 h，離心去除藥渣后合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定生藥量后置于4℃存儲備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑SDF-1 ELISA檢測試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）；SDF-1、CXCR4、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）-3、MMP-9、MMP-13一抗（美國Abcam公司）；二抗（美國Millipore公司）；SDF-1、CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13引物（福州尚亞生物技術(shù)有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific公司）；ABI實(shí)時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；蛋白核酸分析儀（美國Beckman Coulter公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 含藥血清制備 健康2月齡SPF級SD大鼠36只，雌雄各半。按1∶2的比例隨機(jī)分為空白血清組12只與含藥血清組24只，動物給藥劑量根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”換算［10］，含藥血清組大鼠按4.5 g／（kg·d）予榮筋拈痛方藥液灌胃，分上午、下午2次灌胃；空白血清組于同等條件下灌服等體積的生理鹽水。連續(xù)灌胃7 d，采血前禁食12 h，分別在末次灌胃2 h后，于10%水合氯醛麻醉下腹主動脈采血，4℃冰箱過夜，3 000 r／min離心15 min，分離血清，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm濾膜過濾除菌，分裝，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 滑膜細(xì)胞獲取 參照文獻(xiàn)［11］完整剝離滑膜組織，簡要步驟如下：2月齡SD大鼠脫臼處死后，膝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚，分離肌肉，露出髕骨，繼續(xù)向下分離，可見平滑光亮滑膜組織，剪刀分離滑膜層和纖維層，取出滑膜層組織。將獲取的滑膜組織放于裝有含雙抗的生理鹽水中，備用，之后采用Ⅱ型膠原酶消化法獲取滑膜細(xì)胞［12］。

2.3 分組與干預(yù) 采用4%木瓜蛋白酶注射關(guān)節(jié)腔的方法建立KOA模型大鼠，空白組為正常大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞，模型組和治療組為KOA模型大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞?？瞻捉M與模型組細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)10%空白血清培養(yǎng)，治療組用體積分?jǐn)?shù)10%含藥血清培養(yǎng)，干預(yù)24 h后檢測相關(guān)指標(biāo)。

2.4 退變軟骨細(xì)胞模型 參照課題組前期取材方法，無菌條件下游離并截取4周齡SD膝關(guān)節(jié)，置入無菌培養(yǎng)皿，帶入超凈工作臺操作。先用PBS充分漂洗，刮除關(guān)節(jié)周圍附著的肌肉、脂肪等組織后用PBS充分漂洗。用刀片削取每個關(guān)節(jié)表面的軟骨，PBS充分漂洗軟骨小塊3次，采用酶消化法，消化、獲取正常軟骨細(xì)胞［13］，培養(yǎng)、傳代至第三代，再予10 ng／mL的IL-1β誘導(dǎo)24 h，獲得退變軟骨細(xì)胞［14］。

2.5 干預(yù) 建立退變軟骨細(xì)胞模型后，分別更換空白和含藥血清干預(yù)后的滑膜細(xì)胞上清液，即空白組，用10%空白血清干預(yù)后的空白組滑膜細(xì)胞上清液培養(yǎng)；模型組，用含10%空白血清干預(yù)后的模型組滑膜細(xì)胞上清液培養(yǎng)；治療組，用含10%含藥血清干預(yù)后的治療組滑膜細(xì)胞上清液培養(yǎng)；培養(yǎng)24 h后檢測相關(guān)指標(biāo)。

2.6 ELISA法檢測滑膜細(xì)胞上清液SDF-1含量

收取各組滑膜細(xì)胞上清液，參照試劑盒說明書測定各組樣本SDF-1含量。

2.7 Real-time PCR法檢測滑膜細(xì)胞SDF-1和退變軟骨細(xì)胞中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA表達(dá) 收集各組細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，核酸分析儀檢測各樣本RNA濃度和OD260／280值。根據(jù)試劑盒說明書，取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。配置Real-time PCR反應(yīng)體系：Mix（2×）10 μL，Rox（50×）0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，DEPC水7.8 μL，cDNA 1 μL。引 物 序 列CXCR-4：上 游AACTGAACGCTCCAGAATGT，下游GAGAAACCAC ACAGCACAAC；SDF-1：上游GGCTTTGAGGGAGG GTTT，下游TGCGGAGGAATGACTTCTG；MMP-3：上游5'-GGCACCAGTCAACCTCAA-3'，下游5'-CCAT CTACACAGAGACAGTTACTT-3'；MMP-9：上游5'-GCTGCTCCAACTGCTGTA-3'，下游5'-CATCCAAT AAATTCCTCTGTCCCTA-3'；MMP-13：上游5'-GCT AAGGCAGACATAGTAAGGTAGAT-3'，下游5'-ACA CATCAGTAAGCACCAAGT-3'。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火34 s，持續(xù)40個循環(huán)，最后95℃15 s、60℃延伸1 min。以β-actin為內(nèi)參基因，計(jì)算各目的基因2-ΔΔCt，比較各目的基因mRNA相對表達(dá)水平。

2.8 Western blot法檢測各組滑膜細(xì)胞中SDF-1和退變軟骨細(xì)胞中CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入含1 mmol／mL PMSF的RIPA裂解液提取各組總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，室溫封閉1 h，分別用SDF-1、CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，滴加ECL顯影液曝光顯影。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，用（±s）表示，采用one-way ANOVA分析，方差齊用LSD檢驗(yàn)，方差不齊用Games-Howell法檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布以中位數(shù)（四分間距位）表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 3組大鼠滑膜細(xì)胞上清液中SDF-1含量比較

見圖1。

圖1 3組大鼠滑膜細(xì)胞上清液中SDF-1含量比較

3.2 3組大鼠滑膜細(xì)胞SDF-1 mRNA和蛋白表達(dá)比較 見圖2、圖3。

圖2 3組大鼠滑膜細(xì)胞SDF-1 mRNA表達(dá)比較

圖3 3組大鼠滑膜細(xì)胞SDF-1蛋白表達(dá)比較

3.3 3組退變軟骨細(xì)胞CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白表達(dá)比較 見圖4、圖5。

圖4 3組退變軟骨細(xì)胞CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA表達(dá)比較

圖5 3組退變軟骨細(xì)胞CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表達(dá)比較

4 討 論

OA通常為關(guān)節(jié)內(nèi)的局部炎癥常伴隨關(guān)節(jié)滑膜炎，滑膜通過分泌各類因子進(jìn)入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，從而參與調(diào)節(jié)軟骨及軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的代謝活動?；さ姆蚀笸ǔｎA(yù)示著關(guān)節(jié)的炎癥和軟骨及其基質(zhì)的降解［15］。滑膜可以分泌基質(zhì)降解酶直接參與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，同時可啟動其他軟骨降解的信號通路，使得軟骨破壞［16］。

SDF-1是骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的CXC類趨化蛋白，可由骨髓基質(zhì)細(xì)胞、骨髓內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生［17-18］。SDF-1在人體內(nèi)有兩種受體，CXCR4和CXCR7。在趨化因子中，SDF-1是CXCR4的唯一配體，KOA患者關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞會分泌SDF-1到滑液中［19］，SDF-1可與軟骨細(xì)胞上已存在的CXCR4結(jié)合從而影響軟骨細(xì)胞的增殖、分化和成熟。有研究指出SDF-1可通過結(jié)合軟骨細(xì)胞表面的CXCR4受體，從而激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)酶（Erk）及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)酶相關(guān)激酶（p38 MAPK）等信號通路，導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-3、9、13的合成增加，使得軟骨細(xì)胞外基質(zhì)破壞［19-20］。OA患者關(guān)節(jié)液中SDF-1的濃度顯著高于健康人，且濃度與嚴(yán)重程度成正比［21］。但SDF-1對相關(guān)MMP的誘導(dǎo)只對軟骨細(xì)胞有效而對滑膜細(xì)胞無作用［22-23］?？傊?，SDF-1／CXCR4信號通路在KOA患者的病理進(jìn)程中具有重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)OA滑膜細(xì)胞上清液中SDF-1含量明顯高于正?；ぜ?xì)胞上清液組，經(jīng)過榮筋拈痛方含藥血清干預(yù)后SDF-1含量降低。進(jìn)一步采用Real-time PCR和Western blot法，從基因和蛋白兩個方面檢測滑膜細(xì)胞中SDF-1表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與空白組相比，模型SDF-1表達(dá)明顯增多，而經(jīng)過榮筋拈痛方含藥血清治療后SDF-1表達(dá)量明顯下降。與此同時，本研究同時采用Real-time PCR和Western blot法檢測血清干預(yù)后的滑膜細(xì)胞上清液對退變軟骨 細(xì) 胞CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA和蛋白的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白組相比，模型組CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13表 達(dá) 明 顯 增多，經(jīng)過滑膜細(xì)胞上清液干預(yù)后CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13表達(dá)量明顯下降。可見，榮筋拈痛方可能是通過調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞中SDF-1和軟骨細(xì)胞中CXCR4表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞中MMP-3、MMP-9和MMP-13表達(dá)，起到防治KOA的作用，但是否是唯一途徑，尚需要后期研究進(jìn)一步驗(yàn)證。